學位論文
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Item 利用定點突變4,5多巴-雙加氧酶探討其受質選擇性及動力學之影響(2022) 簡雯棋; Chien, Wen-Chi本研究主題就是在紫茉莉花中萃取的4,5-多巴雙加氧酶 (DOPA 4,5-dixoygenase, MjDOD)可催化左旋多巴 (Levodopa, L-DOPA)，但對多巴胺 (Dopamine, DA)也會產生相似的催化，然後運用不同位點突變胺基酸得其突變體，分別針對左旋多巴以及多巴胺進行酵素催化反應使其產生兩種不同的甜菜黃素 (Betaxanthin)，而這兩種不同的甜菜黃素在430 nm有最高吸收鋒，因此可以最終產物甜菜黃素在430 nm的吸收值與濃度作圖，再透過Michaelis–Menten equation得出最大反應速率 (Vmax) 和酵素親和力 (Km)。此外，4,5-多巴雙加氧酶中特定的氨基酸位置突變以改變對於基質的選擇性與活性，從中挑選出對於多巴胺或左旋多巴具有獨特專一性的4,5-多巴雙加氧酶突變體，分別有比起野生型對於L-DOPA更專一的F252Y突變體，還有對於DA有良好選擇性的雙點突變體N249D&F252Y。Item 開發大腸桿菌之雙訊號多巴胺全細胞生物感測器(2017) 林于寬; Lin, Yu-Kuan多巴胺為一兒茶酚胺類之神經傳導物質且在人體中扮演著不可或缺的角色，而不正常的多巴胺濃度會導致一些疾病的產生，如：帕金森氏症以及亨丁頓舞蹈症。因此檢測多巴胺是一門很重要的課題。我們設計了一組感測多巴胺之大腸桿菌全細胞生物感測器，運用大腸桿菌中單胺類調控組作為感測機制，並以紅色螢光蛋白作為訊號來源，針對多巴胺濃度能夠有良好的相關係數以及偵測極限 (1.43M)，且將紅色螢光蛋白置換為紫茉莉之4,5-多巴雙加氧酶 (MjDOD)，4,5-多巴雙加氧酶能將左旋多巴轉換為甜菜醛胺酸 (具有432nm特徵吸收峰，為甜菜黃色素之前驅物)，推測多巴胺也能透過4,5-多巴雙加氧酶催化而形成同樣具有432nm特徵吸收峰的6-去羧基甜菜醛胺酸，置換4,5-多巴雙加氧酶後在偵測多巴胺以及左旋多巴時，同時具有相當不錯的相關係數以及偵測極限，也經由酵素的置換，我們成功地消除了苯乙胺以及苯乙醛的干擾。最後我們結合紅色螢光蛋白以及4,5-多巴雙加氧酶，設計出足以區分苯乙胺、多巴胺、左旋多巴以及腎上腺素等四種類似物，透過偵測紅色螢光以及432nm特徵吸收峰，這四種類似物的訊號消長不盡相同，因此可以製作其特徵訊號圖譜。此生物感測器有著相當不錯的偵測極限以及區分多巴胺類似物的特性，在未來偵測與多巴胺相關的疾病能夠更加精準且有效。Item 利用微生物 MerR 家族與二元調節系統設計銅離子生物感測器(2016) 陳姵璇; Chen, Pei-Hsuan本研究使用微生物抵抗銅離子的調控系統，利用基因重組技術設計量測銅離子的全細胞生物感測器。本研究分別使用青枯桿菌 (Ralstonia eutropha) 中屬於 MerR 家族的 cue 基因調控組，以及耐金屬貪銅菌 (Cupriavidus metallidurans) 中屬於二元調節系統的 cop 基因調控組，以紅色螢光蛋白作為訊號輸出的報導基因來建構質體，設計出不同的銅離子生物感測器。其中，cueR 生物感測器除了能夠量測銅離子之外，在適當的前處理下還能分別量測銀離子與金離子。根據世界衛生組織所公布的飲用水水質準則，飲用水中銅離子的含量不得超過 2 mg/L (31 μM)，本研究所設計的 cueR 生物感測器以耐金屬貪銅菌作為質體之宿主時，量測銅離子的最低偵測極限為 25.54 μM，能夠量測飲用水中銅離子是否超標。而在 copSR 生物感測器的實驗中，嘗試使用不同的 cop 啟動子，建構出多種 copSR 生物感測器。也嘗試表現紫茉莉的 4,5-多巴雙加氧酶 (DOPA 4,5-Dioxygenase of Mirabilis jalapa, MjDOD)，透過添加 L-多巴 (L-3,4-dihydroxyphenylalanine, L-DOPA) 催化產生出甜菜黃色素 (betaxanthin)，以色素的生成作為輸出訊號，進而縮短檢測時間。此外，我們嘗試在不同來源的水樣品中額外添加銅離子進行量測，證明本研究設計的 copSR 生物感測器不會受到水中其他雜質干擾而影響銅離子量測。本研究設計出多種銅離子生物感測器，隨著每種生物感測器偵測範圍不同，可望運用在不同的需求上。