學位論文
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Item 脊髓小腦運動失調症之族群遺傳分析與CTG三核苷重複擴增的分子致病研究(2007) 林玄原; Hsuan-Yuan Lin脊髓小腦運動失調症（SCAs）為一群顯性遺傳的神經退化性疾病，目前已確定的各型中，絕大多數是由致病基因中的三核苷酸或五核苷酸重複擴增所致。本論文首先建立了臺灣地區族群的SCAs致病基因之遺傳資料庫，並且檢測尚未確定的病例。在我們的檢測結果中，臺灣SCAs族群當中最多的為SCA3；且臺灣的族群分佈頻率與日本及高加索人群極為相似。此外，我們亦發現五名帕金森氏症患者具有SCA8或是SCA17基因的突變 ，顯示這兩種基因的突變可能以非小腦症狀的表現型來顯現。 SCA8與其他的SCAs不同之處在於其雖然也是由三核苷酸重複擴增所造成，但其致病基因中的三核苷酸為CTG，且位於非轉譯區，而非像其他型SCAs絕大多數為轉譯區中的CAG擴增。此外，SCA8基因所轉錄RNA的5端，與KLHL1基因之mRNA的5端互補，即為KLHL1基因的反意RNA。本論文的第二部份為利用細胞與基因轉殖小鼠模式來探討SCA8的可能致病機轉。在細胞模式中，我們發現CTG擴增的SCA8對於KLHL1基因表現的抑制較不若正常SCA8來得強；此外，雖然之前的研究認為SCA8基因並不會進行轉譯，但我們的研究證實了SCA8基因中的開放解讀架構（open reading frame，ORF）確實可以轉譯成蛋白質，且CTG擴增的SCA8與ORF1都會形成細胞內不可溶的包涵體。因此，SCA8的反意調控與可轉譯的開放解讀架構都可能與致病過程相關。我們亦建立SCA8的基因轉殖小鼠模式，雖然行為測定與小腦組織形態上都未發現異狀，但卻出現四肢緊抱（clasping）的現象。因此，此現象或許可提供作為致病機轉或是藥物研究之指標。Item 脊髓小腦運動失調症：SCA2、SCA14的遺傳檢測及擴增SCA17 TBP蛋白與HMGB1蛋白的交互作用分析(2007) 陳襄銘; Hsiang-Ming Chen脊髓小腦運動失調症(Spinocerebellar ataxia；簡稱SCA)，為一種異質性的神經退化性疾病，大部分起因為特定基因上三核苷重複擴增的結果，患者在小腦、腦幹、脊髓以及週邊神經系統會出現漸進式的退化現象。現在已知的脊髓小腦運動失調症約有28種亞型，本研究第一部份將重點放在屬於三核苷重複擴增的第二型(SCA2)以及不屬於三核苷重複擴增的第十四型(SCA14)的遺傳分析。這兩型的致病原因分別為Ataxin-2基因的CAG三核苷重複擴增和protein kinase Cγ (PRKCG)基因的突變。首先會對長庚醫院神經內科所提供的正常人(179位)、運動失調症(ataxia)患者(15位)、帕金森氏症(Parkinson's disease)患者(137位)、失智症(dementia)患者(124位)、震顫(tremor)患者(84位)及其他神經疾病患者(舞蹈症、肌張力異常症等，41位)進行SCA2 CAG三核苷重複擴增的分子檢測，結果並未發現任何Ataxin-2 CAG重複擴增的等位基因。在SCA14的遺傳分析方面，利用PCR增幅及DNA定序，檢視了30位帕金森氏症徵候群(Parkinsonism)患者PRKCG基因最常被報導發生突變的表現子(exon) 4及5，結果亦未發現任何突變。本研究的第二部份著重在分析SCA17 TBP蛋白與HMGB1蛋白的交互作用。首先製備包含20、45、61個麩醯胺的N端TBP (nTBP-Q20/Q45/Q61)及全長TBP (fTBP-Q20/Q45/Q61)的GST融合蛋白，再利用石英晶體微量天平(Quartz Crystal Microbalance)來量測TBP重複擴增對其與HMG1分子間交互作用的影響，結果發現N端TBP或全長TBP與HMG1之間的交互作用相同，但不同polyQ長度之TBP蛋白與HMG1之間的交互作用不同，其中以nTBP-Q45的結合力最強(ΔHz = 13.0)，nTBP-Q61的結合力最弱(ΔHz = 4.3)。故推測HMGB1可能和TBP的polyQ部位結合。Item 第十七型脊髓小腦運動失調症:遺傳檢測及發展生化暨酵母菌的藥物篩檢模式(2007) 黃慧茹脊髓小腦運動失調症(Spinocerebellar ataxia，簡稱SCA)是一群漸進性神經退化疾病，其大多是由於三或五核苷酸重複擴增所致，主要臨床症狀包括動作失調及發音障礙，主因是小腦退化及萎縮，目前計有28種之多。第十七型脊髓小腦運動失調症(SCA17)是位於染色體上6q27位置的TATA binding protein (TBP)基因CAG三核苷重複擴增所引起的神經退化性疾病。TBP基因所做出來的蛋白為細胞內重要的轉錄調節因子，而擴增的多麩醯胺(polyQ)可能影響TBP蛋白的功能。根據許多研究顯示帶有多麩醯胺擴增的蛋白會傾向於形成不溶解的聚集物(detergent-insoluble aggregate)，進而造成神經細胞的功能異常、病變或死亡。針對TBP基因上CAG三核苷重複次數的族群研究顯示，在正常人族群中，TBP基因CAG三核苷重複次數大都為25~42，在家族性及偶發性的運動失調患者中，所發現的CAG三核苷擴增次數為43~66。本論文首先對長庚醫院神經內科所提供的正常人(197位)、運動失調症(ataxia)患者(13位)、帕金森氏症(Parkinson's disease)患者(103位)、失智症(dementia)患者(122位)、原發性顫抖症(essential tremor)患者(101位)及其他神經疾病患者(舞蹈症、肌張力異常症等，29位)進行SCA17 CAG三核苷重複擴增的分子檢測，結果並未發現任何擴增的等位基因，各族群中皆以36個重複序列的等位基因最常見。本研究的第二部份擬建立生化及酵母菌藥物檢測模式，在生化模式上先後製備了包含3~61個僅包含多麩醯胺鏈(GST-Qn)及包含多麩醯胺的不完整N端TBP (GST-tTBP-Qn)、完整N端TBP (GST-nTBPQn)、全長TBP (GST-fTBPQn)的GST融合蛋白，利用filter-trap assay及Western blot方法作為藥物測試，但可能因為TBP蛋白的溶解性及1C2抗體的適用性，控制組及待測組藥物皆無法有效抑制帶有多麩醯胺擴增蛋白的聚集。另外在酵母菌藥物篩檢模式上，製備了兩組不完整N端TBP (tTBP-Qn-EGFP)、完整N端TBP (nTBP -Qn-EGFP)綠螢光融合蛋白，表現於不同品系的酵母菌中，在半乳糖誘導融合蛋白表現模式下，可能原因為多麩醯胺的長度未達到影響酵母菌生長的長度，或半乳糖誘導效果不佳，表現多麩醯胺擴增綠螢光融合蛋白(tTBP-Q54-EGFP、nTBP-Q48-EGFP)的酵母菌，其生長與控制組(tTBP-Q20-EGFP、nTBP-Q20-EGFP)相較，並無差異。本篇論文提供發展生化及酵母菌藥物篩檢模式雖未達到預期結果，仍可提供未來相關研究的參考。Item 第八型脊髓小腦運動失調症之果蠅模式建立與致病機制研究(2005) 項聖文; Sheng-Weng Hsiang壹、中文摘要 脊髓小腦運動失調症（SCAs）為一群退化性神經疾病，其特徵為小腦功能異常，但也常伴隨中樞神經系統其他部位神經性異常，第八型脊髓小腦運動失調症（SCA8）與染色體13q21上的SCA8基因3’端非轉譯區CTG三核酸重複序列擴增相關。本研究嘗試建立SCA8 果蠅模式以供致病機制之研究，將CTG重複序列表現於果蠅複眼時，會造成感光細胞退化，顯見重複序列為致病的重要因子，以原位雜合顯示細胞含重複序列的核酸分子，會聚集於核內形成核酸聚點(RNA foci)；此外先前研究由基因序列分析顯示SCA8不含顯著的開放譯讀區(ORF) ，推論SCA8不會有蛋白質產生，然而以綠螢光蛋白基因接在SCA8尾端轉殖果蠅，發現綠螢光蛋白可因SCA8的轉錄而表現，顯示SCA8基因可能合成蛋白質產物；將SCA8含重複序列的ORF表現時，亦會造成感光細胞退化，且含重複序列核酸會於核內形成核酸聚點，無法輸送至細胞質轉譯成有毒的聚白胺基酸蛋白。由上我們得知重複序列在核酸階層即可造成細胞毒害，文獻指出含CUG重複序列可藉與muscle-blind及PKAAP等核酸結合蛋白形成核酸聚點，降低這類核酸結合蛋白的表現量，而增強CUG重複序列對細胞的毒害；將SCA8果蠅模式置於這些基因缺失的背景下，我們的確發現複眼性狀受到影響。此外我們也發現熱休克蛋白(Hsp70)可減緩果蠅模式的性狀，由此結果推論蛋白質不正常摺疊可能為SCA8致病機制之一。由於SCA8與KLHL1基因（actin結合蛋白）的5’端共用一段DNA序列，且均表現於腦部，我們也試圖了解KLHL1在SCA8的致病機制中是否扮演一定角色；單獨表現KLHL1蛋白於果蠅複眼並未造成明顯性狀，將SCA8重複序列與KLHL1共同表現於感光細胞，也未增加複眼之退化，初步認為KLHL1並非導致SCA8的主因。Item 第八型脊髓小腦運動失調症：CTG三核重複的遺傳分析與細胞模式研究(2005) 洪葦苓脊髓小腦運動失調症(spinocerebellar ataxia；SCA)，為一群異質性的退化性神經疾病，大部分起因於三核重複擴增，患者在小腦、腦幹、脊髓及周邊神經系統等出現漸進式的退化。臨床上SCA不易分類，在多種相關的致病基因被分離後，分子檢測的建立及致病機轉的研究，有助於我們對這群疾病的了解。SCA8和致病基因3'端非轉譯區的CTG三核擴增相關，除家族性及偶發性的運動失調患者外，在阿茲海默氏症(AD)、精神疾病症、帕金森氏症(PD)及其他類型之SCA患者中，甚至於極少數的正常人中，亦可見到異常的CTG三核擴增(68 ~ 800個)。本研究首先建立台灣正常人及上述退化性神經疾病患者，其SCA8基因CTG重複之遺傳資料庫，結果發現有5個擴增的allele，分別來自1個AD患者、3個PD患者與1個SCA3患者。擴增之allele經定序分析顯示包含63 ~ 93個三核重複。另一方面也構築含有不同CTG重複(0, 23, 88, 157個)的SCA8 cDNA於表現載體上，轉移至人類胚胎腎細胞(HEK-293)或老鼠胚胎癌細胞(P19)，來研究SCA8可能之致病機轉。結果發現包含0個CTG重複之SCA8基因表現最好，當CTG重複23-157次時，SCA8基因的表現量下降，但下降程度不隨CTG擴增而有明顯差異，且RT-PCR分析顯示SCA8 mRNA在細胞核、質的分布情形與穩定性均不受CTG重複次數影響。和第一型肌強直萎縮症(myotonic dystrophy type 1；DM1)一樣，擴增之SCA8 RNA (CTG重複88或157個)在核內會形成RNA foci。而在SCA8和TBP cDNA或(CAG)36之共轉實驗中，也發現SCA8對TBP RNA或(CAG)36 RNA有類似antisense RNA之作用。上述結果可幫助我們初步了解SCA8表現時其RNA可能造成之效應。