生命科學專業學院—生命科學系

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本系學士班之教育目標為「培育優良之生物科教師及生命科學研究人才」雙軌並行。

因應少子化的衝擊,本系調整相關員額及教學資源之分配,在課程設計及學習活動上,特別注重學生基礎學識、研究能力和研究方法的訓練,使學生可依個人志趣作學習規劃,畢業後有更寬廣的出路。

本系碩、博士班之教育目標則以「培養生命科學研究人才」為主,並兼顧師資培育,故課程設計及學習活動以培養獨立研究能力為主要目標。

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    以癌細胞株與動物模式探討吲哚結構化合物對於腫瘤細胞的生長抑制及其機轉
    (2011) 黃信銘; Sin-Ming Huang
      背景:前人研究指出,多種吲哚類化合物具有抑制細胞分裂的效果,進而導致癌細胞的細胞週期停滯和細胞凋亡。我們實驗室先前的研究證明,3-indole這個新穎的吲哚結構化合物可在30M的濃度下,藉由粒線體途徑(mitochondrial pathway)引起肺癌細胞凋亡,並在動物模式中抑制腫瘤生長。目的:本篇研究探討低濃度3-indole(10M)對癌細胞造成的生長抑制及其分子機轉。另外,我們也發展了另一個新穎的吲哚類化合物—SK228。我們利用細胞及動物模式,探討其對癌細胞生長的影響及其分子機轉。結果:在以10M 3-indole處理A549、CL1-1及H1437肺癌細胞株之後,發現癌細胞生長被抑制,並且造成細胞週期停滯於G1期。3-indole引起的DNA損傷由Comet assay所驗證,並且數種DNA損傷反應蛋白質及G1期調控蛋白質(例如RB、p53、p21和 SMAD3)在3-indole處理後表現量增加。我們進一步發現,3-indole也會引起DNA損傷反應路徑—ATM/ATR路徑的活化;另外,活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)的抑制劑rotenone能降低3-indole引起的DNA損傷和ATM/ATR反應路徑的活化。這些結果指出,ROS在3-indole引起的癌細胞生長抑制中,扮演重要的角色;動物異種移植(xenograft)實驗進一步證明,3-indole在細胞模式中活化的反應路徑,亦可見於動物模式中。在SK228的研究中,我們發現該化合物可有效的抑制肺癌及食道癌細胞生長,而對於正常肺纖維母細胞則無明顯影響。在以SK228處理過的細胞中,觀察到代表細胞凋亡的「細胞膜內膜外翻」的現象,指出SK228會引起細胞凋亡。我們進一步驗證了,SK228藉由與DNA的結合、鑲嵌及產生ROS而造成DNA的結構改變及損傷。SK228的處理會促進cytochrome c從粒線體釋放至細胞質中,以及caspase-3 和 caspase-9的活化,但不影響caspase-8的活性,並且這些反應可被ROS的抑制劑rotenone所抑制。另外,BCL-2家族的蛋白質表現量及粒線體外膜的完整性,亦受到SK228的影響。我們更進一步發現,SK228藉由降低FAK/paxillin路徑及RhoA的活性而抑制癌細胞的轉移能力。另外,動物實驗也證明SK228可有效抑制腫瘤細胞的生長,並且沒有引起明顯的體重變化或血液學、生化學上的明顯傷害。而且,藉由TUNEL assay和免疫組織化學染色證明,SK228可在動物模式中誘發癌細胞的細胞凋亡,進而抑制腫瘤生長。結論:本實驗證明,低濃度3-indole會藉由產生ROS而造成DNA損傷,並引起ATM/ATR路徑和TGF-β/SMAD路徑的活化,進而使細胞產生細胞週期G1期停滯現象。另外,SK228會藉由造成DNA損傷及ROS的產生而誘使癌細胞經由粒線體路徑進行細胞凋亡,並且也證明SK228可以在低濃度下有效抑制癌細胞的轉移能力。
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    1. 抑制肺癌腫瘤細胞增生的新穎小分子藥物篩選及其反應機制2. 玫瑰樹鹼對肺癌細胞誘導Akt及p53核移動及生長抑制
    (2012) 游雅竹; Ya Chu Yu
    1.本論文使用肺癌細胞株為模式,自42個化學合成有機小分子,利用細胞生長速率測試 (MTT assay),篩選出在低濃度下可以降低細胞生長速率之藥物。其中oxazoline衍生物MZ-01-059能夠有效在5 μM下降低A549細胞的生長速率。次由細胞群落分析證實MZ-01-059可以抑制癌細胞的增生。為了確認非小細胞肺癌的生長率下降是否與細胞凋亡相關,實驗再利用propidium iodide染色後DNA,進行後流式細胞分析,觀察細胞週期變化。實驗結果顯示MZ-01-059會讓具有野生型p53之細胞株A549及H460產生細胞凋亡。其中以H460細胞株較為顯著;但對不具有p53之H1299細胞,則會停滯在S及G2/M週期。另由二維流式細胞儀分析結果,確立H460肺癌細胞主要是以晚期細胞凋亡 (late apoptosis) 方式降低細胞存活率。由西方轉漬法鑑定與細胞凋亡相關的蛋白,發現MZ-01-059處理後細胞,會活化腫瘤抑制基因p53,此外也會使pro-caspase-3以及poly ADP ribose polymerase切割;而LC3-II (microtubule-associated protein 1 light chain 3) 在A549及H1299細胞株會增加,因此推斷這兩種細胞是先以細胞自噬保護細胞,再產生細胞凋亡,證實這個藥物所引發細胞凋亡與細胞自噬相關。本論文結果也顯示MZ-01-059能夠在低濃度下誘導活化在非小細胞肺癌引發不同程度的細胞凋亡,且與p53活化有關。 2.拓樸異構酶II抑制劑玫瑰樹鹼 (ellipticine) 為具有抑制癌細胞生長的抗癌藥物,本實驗室過去研究指出藥物可經由活化p53,使人類非小細胞肺癌A549細胞株凋亡。本論文持續探討細胞生長因子Akt對於p53進入細胞核的影響,研究使用轉殖p53質體至H1299的穩定細胞株 (HW16)。但當加入外源Akt會增加ellipticine對細胞生長的抑制效應,並讓sub G1週期細胞數目上升,而Akt及p53會被共同誘導移入細胞核內,DNA修補酶PARP也受到剪切。但將AktS473位點突變後,誘導產生的細胞凋亡會被抑制;而AktT308位點突變後抑制能力則較不明顯。Ellipticine所引發的細胞凋亡也與細胞自噬的形成有關,加入Akt後細胞內LC3-I轉換成LC3-II的比例增加,但當AktS473位點突變後,所誘導的細胞自噬也會降低。因此本研究顯示ellipticine所誘導產生的細胞凋亡是與Akt及p53移動至細胞核及細胞自噬形成有關,且AktS473位點的磷酸化對於藥物引發的細胞凋亡具有重要性。
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    三環藥物Teroxirone對非小細胞肺癌細胞增生機制的探討
    (2012) 林楷涵; Kai-Han Lin
    肺癌細胞依其組織型態可分為兩類:小細胞肺癌 (small cell lung cancer, SCLC) 以及非小細胞肺癌 (non-small cell lung cancer, NSCLC),而其中大多數屬於非小細胞肺癌。目前在臨床治療上經常使用的抗癌藥物 (例如: camptothecin, doxorubicin, etoposide, cisplatin) 容易產生抗藥性,導致治療的困難,因此本文開發目前臨床上還未徹底了解,但具有抗癌效果的化合物。 研究目標是發展小分子且低劑量的三環氧化物teroxirone,了解teroxirone如何引發細胞凋亡。實驗以MTT及細胞群落分析 (colony formation assay) 確認teroxirone確實能降低非小細胞肺癌的存活率。接著要確認非小細胞肺癌細胞的存活率下降的確是由於細胞凋亡所造成。再利用單細胞凝膠電泳 (single cell gel electrophoresis (SCGE) / comet assay),偵測teroxirone是否造成DNA 損傷。再利用propidium iodide (PI) 染色觀察teroxirone對細胞週期的影響,再利用二維流式細胞儀及DNA片段化實驗觀察teroxirone所誘導的細胞凋亡。 實驗結果顯示,teroxirone都會對NSCLC細胞造成不同程度DNA損傷,且細胞凋亡與p53的基因型有關。
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    營養缺乏對神經瘤母細胞轉殖入PPP2R2B的影響
    (2011) 李蕙芳; Hui Fang Li
    蛋白磷酸酶2A (PP2A) 是絲胺酸/酥胺酸去磷酸酶,由催化次單元、骨架次單元與調控次單元所組成的三體蛋白。其中PPP2R2B (Bβ)是特別作用在腦部的調控單元,會經由選擇性剪接後,生成兩種蛋白異構物:Bβ1與Bβ2。前者表現於細胞質中,後者表現於粒線體。過去研究顯示,異常表現PP2A的細胞與神經退化疾病的發生有關。過去本實驗室以SK-N-SH轉殖入Bβ1基因與Bβ2基因建立穩定細胞株。實驗顯示Bβ1與Bβ2是藉由細胞自噬(autophagy)方式維持細胞生存。過去的研究中發現,這類轉殖的穩定細胞會受外來氧化壓力的影響,並在細胞自噬相關基因失活時提高其細胞存活。 過去的研究中顯示,細胞株在飢餓壓力下,會以細胞凋亡維持細胞存活。本計畫以HBSS (Hank’s Balanced Salts Solution) 作為細胞飢餓壓力的來源。研究結果顯示轉殖Bβ1的SK-N-SH細胞在HBSS環境會促使細胞自噬。並試以細胞自噬抑制劑20μM 3-MA處理,發現3-MA可抑制因飢餓壓力所造成的細胞自噬,進而減少後續的細胞凋亡,而使細胞的存活提高,但是抑制lysosome及autophagosome的抑制劑Bafilomycin A1,則沒有減少後續細胞凋亡的效果。此外,添加胺基酸glutamine可以減少的細胞自噬,進而降低細胞凋亡,但非必需胺基酸(NEAA)則無此效果。 此項研究可對於研究神經細胞異常表現PPP2R2B後,在不同環境壓力下,提供更好的研究模式及瞭解細胞自噬生成機制。
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    環境壓力對於神經母細胞過度表現細胞質或粒線體PPP2R2B之影響
    (2012) 宋亭潔; Ting-Chieh Sung
    Protein phosphatase 2A (PP2A)是serine/threonine去磷酸酶的一種,能調節細胞的生長、存活和凋亡。哺乳類動物中,Bβ次單位PPP2R2B是PP2A在腦神經細胞中的專一表現的次表型。當 Bβ基因有所缺失或過度表現時,會造成神經細胞的病變。本研究使用可以持續且穩定過度表現細胞質PPP2R2B蛋白(Bβ1)及粒線體 PPP2R2B蛋白(Bβ2)的神經細胞株,觀察飢餓壓力、低氧環境和Tunicamycin(TM)等藥物引起的內質網壓力,對細胞表型的影響。 研究結果顯示Bβ1細胞在飢餓壓力下,其粒線體膜電位及存活率都會下降,而sub-G1期比例也有顯著提升,代表產生細胞凋亡。但若以細胞自噬抑制劑Bafilomycin A1預處理,則會抑制因飢餓壓力引起的細胞自噬,進而減緩後續的細胞凋亡,但3-methyladenine (3-MA)則無此效果。 另一方面,Bβ2細胞株的存活率會因為受到內質網壓力而有下降,由流式細胞儀及螢光免疫染色發現細胞內的酸性液泡會增多,代表有細胞自噬增加,但Bβ1細胞株則否。但以細胞自噬抑制劑3-MA先對細胞作前處理24小時後,再施以內質網壓力,則各Bβ2細胞株的sub-G1 期比例皆會降低,而酸性液泡胞器的密度也明顯降低。 此外,在低氧壓力對於過度表現PPP2R2B的蛋白,無論是細胞質或粒線體,皆會造成sub-G1 期上升,引發不同程度的細胞凋亡。 本論文針對過度表現PPP2R2B的細胞株分別由飢餓壓力、內質網壓力和低氧環境下,觀察細胞所產生的表型變化,模擬PPP2R2B過度表現之神經退化病變的產生,並瞭解病變機制,祈能對PPP2R2B相關疾病的研究與治療有所助益。
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    raw透過限制Dpp的表現抑制果蠅心臟細胞的死亡
    (2009) 楊勝安; Sheng-An Yang
    Raw是djnk作用途徑的組成分子之一,且在背部癒合時能夠調控dpp在leading edge的表現。raw突變的果蠅胚胎中,Dpp的表現範圍於胚胎發育中期(第12-14時期)時將會顯著擴張。以往的研究證實在中胚層表現過多的dpp會造成心臟先驅細胞的增生,而raw突變的果蠅在第13-14時期時,心臟先驅細胞也會過度表現,且心臟細胞的增生與過度表現的dpp於時空上是一致的。然而到了胚胎發育的晚期,多種類型的心臟細胞表現卻都消失。因為在raw突變的果蠅胚胎中,在背部的外胚層和中胚層都有大量的細胞死亡,因此我們假設心臟細胞的缺失是由細胞凋亡所引起。另一方面,因為死亡的細胞和過度表現的dpp於時空上也有高度的一致性,表示過量的dpp可能是造成果蠅細胞凋亡的原因。在本研究中,我們也證實單獨表現dpp即可造成細胞凋亡,且細胞死亡的程度與dpp的活性成正比。此外我們也在中胚層表現顯性抑制的dTAK1而減少了raw突變中的心臟細胞凋亡,證實dpp是透過dTAK1而造成細胞的死亡。另一方面dTAK1也被證實能夠活化dpp及djnk的表現,這代表中胚層的djnk訊號將會持續的被來自背部外胚層大量表現的dpp所活化。再者,我們也證實表現顯性抑制的p53可以減少因為在中胚層大量表現dTAK1所造成的細胞凋亡。因為在哺乳動物中,BMP訊息路徑所造成的細胞凋亡也由dTAK1所中介,因此由BMP所造成的細胞凋亡於演化上應該是非常保守的。
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    非小細胞肺癌細胞轉殖突變Akt基因對玫瑰樹鹼抗藥性的影響
    (2008) 陳詩萍; Shih-Ping Chen
    拓樸異構酶抑制劑ellipticine是具有抗癌效果的化學治療藥劑之ㄧ,但它在肺癌化學治療效應報導不多。本研究發現ellipticine可抑制人類非小細胞肺癌(NSCLC)A549細胞株的生長。但轉殖突變Akt-Ser473質體至細胞後,由ellipticine所誘導產生的細胞凋亡會被抑制。更多證據顯示ellipticine可調節細胞內部生長存活相關因子Akt與p53共同移動至細胞核,而當轉殖突變Akt-Ser473質體後,p53與Akt的核移動則會被抑制。此外,轉殖突變Akt-Thr308質體雖會抑制細胞凋亡的發生,但其效應較Akt-Ser473不明顯。此外,轉殖野生型p53進入p53缺失的H1299細胞株後,也會有類似的效果﹔但是若轉殖突變p53,則不會有這種效果。因此,可以看出ellipticine可促進細胞p53與Akt移動至細胞核及Akt於Ser-473位點的磷酸化,得以調控ellipticine所引發的細胞凋亡。有更多的證據顯示A549細胞株經由ellipticine所引發的細胞凋亡與細胞自噬的形成有關,這點可使用acridine orange染色來證明。當轉殖突變Akt質體後,ellipticine所誘導的細胞自噬體聚集也會降低,此外,使用細胞自噬抑制劑也有相同的效果。因此本研究顯示ellipticine所誘導產生的細胞凋亡是與Akt及p53移動至細胞核及細胞自噬形成有關。
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    單側輸尿管阻塞誘發氧化壓力對大鼠腎小管細胞之凋亡與自噬表現之影響
    (2008) 賴亭諭; Lai Ting-Yu
    單側阻塞性尿路疾病是指尿液無法經由腎臟或輸尿管流入膀胱,尿液迴流造成腎水腫。其發生原因如單側輸尿管結石、狹窄、腫瘤、受傷等,但仍以腎結石最常見,而單側輸尿管阻塞則是一種適合模擬阻塞性尿路腎臟漸進式纖維化發展過程的病理模型。本研究主要在探討單側輸尿管阻塞造成腎臟損傷過中,活性氧、細胞凋亡與細胞自噬的角色以及細胞凋亡與細胞自噬的關係。本實驗利用大白屬於其右側輸尿管靠近腎臟三分之ㄧ處用兩條繩子分別打結,接著縫合腹腔。之後將老鼠隨機分成八組,第一組無進行結紮手術,其餘分別於術後4hr、8hr、12hr、1天、3天、5天、7天進行生理實驗並抽取500μl腎靜脈血進行自由基測定,另外動物犧牲後取阻塞腎臟,利用西方墨點法測定蛋白表現量;使用免疫組織染色觀察腎臟組織型態。結果發現腎靜脈血液H2O2/OH.-類的自由基於阻塞後四至十二小時期間有上升趨勢,而Catalase和MnSOD的蛋白表現從阻塞四小時開始就隨時間下降;腎臟組織Bax/Bcl-2比值及Caspase 3蛋白表現表現則增加;自噬作用的起始蛋白Beclin1及中期蛋白Atg5-Atg12和後期蛋白LC3表現則在阻塞3天後開始逐漸增加,從切片染色結果也發現自噬作用發生在腎臟近端與遠端腎小管處。我們的結果發現自噬作用蛋白和凋亡作用蛋白表現時間一致,表示自噬作用在單側輸尿管阻塞動物模式中有協同細胞死亡的功能。
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    環境壓力對人類神經細胞過度表現Protein Phosphatase 2A次單位PPP2R2B的影響
    (2009) 鄭琬婷; Cheng Wan-Ting
    Protein phosphatase 2A (PP2A)是屬於serine/threonine去磷酸酶的一種,能調控細胞的生長、存活和凋亡。哺乳類動物中,Bβ次單位是PP2A在腦神經細胞中的專一表現的次表型。當Bβ基因有所損害或過度表現時,會造成神經細胞的病變。本論文分別將能專一表現於細胞質的Bβ1和專一表現於粒線體的Bβ2質體轉殖入神經腫瘤母細胞SK-N-SH中,建立穩定細胞株。利用H2O2和tert-butyl hydroperoxide (tBHP)作為氧化壓力來源,經48小時的處理後,Bβ2細胞株的存活率會急遽下降,由Annexin V和PI雙重染色的結果中證實是因細胞凋亡而降低存活率,但Bβ1細胞株則否。進一步轉殖LC3-EGFP質體和對酸性液泡胞器染色鑑定細胞自噬的發生,可以看出Bβ2細胞株本身便有些微細胞自噬體存在,當經氧化壓力後更引發Bβ2細胞株有更多細胞自噬體出現。但以細胞自噬抑制劑3-methyladenine (3-MA)對細胞作前處理24小時後,再經過氧化物處理,則各Bβ2細胞株的sub-G1期細胞比例皆會下降,而酸性液泡胞器的密度也明顯降低。證明氧化壓力所引起的細胞凋亡是經由細胞自噬路徑而產生。另利用降低培養液中的血清濃度模擬營養缺乏的情況,當無血清培養48小時的Bβ1細胞株之sub-G1期細胞比例較Bβ2細胞株高出許多,當血清濃度降低時,Bβ1細胞株的酸性液泡胞器也較Bβ2細胞株的密度高,證實營養缺乏在Bβ1細胞株所引發的細胞凋亡是經由細胞自噬。本論文針對過度表現PPP2R2B的細胞株分別於氧化壓力和營養缺乏的壓力下,細胞所產生的生理變化,模擬神經退化病變的產生,並瞭解病變機制,祈能對神經退化疾病的研究與治療有所助益。
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    轉殖p53突變基因對化學抗藥性的變異
    (2007) 林佳薇; Chai-Wei Lin
    癌細胞Topoisomerase II活性一般皆高於正常細胞,利用抑制細胞DNA topoisomerase II也是抗癌藥物治療的一個方向,而兩種抗癌藥物Etoposide(VP-16)及Ellipticine都是topoisomerase II的抑制劑,他們都可以抑制癌細胞生長。此外,p53也扮演調控癌細胞的生長週期的重要角色,已知50%以上的肺癌細胞內都有突變的p53。有鑑於此,實驗主要目的就是評估VP-16及Ellipticine對轉殖不同形式p53突變基因細胞株及母細胞株H1299的生長抑制效應與相關機制。另外實驗也嘗試暸解Ellipticine處理含外源性p21Cip1/WAF1的H1437(p53突變)細胞株的生長調控機制。本論文共分為為四部份:第一部份實驗內容為建立穩定p53基因型肺癌細胞株,結果顯示這些轉殖的肺癌細胞株都能持續表現突變形式的p53,只是蛋白質的代謝速率並不一樣。第二部份則是以VP-16處理不同這些轉殖p53基因型肺癌細胞株,結果顯示VP-16處理p53缺失的H1299細胞株,有明顯抑制細胞生長的效果,主要原因是由於降解磷酸化pAkt-Ser473。第三部份的實驗內容是以ellipticine處理不同p53基因型肺癌細胞株。發現ellipticine影響細胞表型變化,與轉殖之p53基因型無關,反而是藉著調控磷酸化pAkt-Ser473,影響細胞存活率及誘導細胞凋亡。第四部份實驗則是轉殖p53所調控的下游基因p21Cip1/WAF1至突變p53肺癌細胞株H1437,再以Ellipticine處理之,結果顯示對p53突變細胞的敏感率,可以藉外源性p21Cip1/WAF1基因而增加。