學位論文
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Item 一、探討新穎Indolylquinoline衍生物誘導非小細胞肺癌細胞凋亡機制 二、鑑定具有清除肺癌幹細胞的藥物(2014) 巫佩岑; Pei-Tsen Wu一.過去研究利用MTT assay以非小細胞肺癌細胞 (non-small cell lung cancer, NSCLC) 為平台篩選了逾五百種小分子化合物，發現含有indole 及quinoline這兩種官能基的小分子化合物compound A，於低劑量下，會抑制A549及H460這兩株NSCLC細胞生長速率及抑制A549腫瘤生長，但對抑癌基因p53缺失的H1299細胞株則無影響，接著使用western blot, MTT及flow cytometry，證實此藥物會誘導表現野生型p53的細胞產生凋亡，但是p53缺失的H1299細胞對此藥物的敏感度較低，而且不會出現凋亡。本論文內容是繼續探討此藥物對NSCLC細胞的調控生長機制與p53基因型的相關性。實驗主要是將p53缺失的H1299，分別轉殖入p53 DNA-binding domain 位點突變的p53R267P以及野生型p53的細胞株，其次再使用MTT 實驗，發現以此藥物10 µM處理H1299轉殖野生型p53細胞48小時後的生長速率較轉殖p53R267P敏感度高35％，繼續使用propidium iodide及Annexin V進行實驗，證實轉殖野生型p53細胞生長率的降低，是細胞凋亡造成，但以此藥物10 µM處理H1299/p53R267P細胞48小時後，細胞凋亡數目比例較H1299/p53細胞降低39.2％，最後由western blot確認細胞凋亡與p53及其下游poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) 裂解及caspase-3活化的蛋白質相關。這些實驗結果證明此藥物對表現野生型p53的H1299/p53細胞有最佳的治療效果，且野生型p53功能在此藥物誘導的凋亡機制中扮演了重要角色。未來實驗中將持續探討compound A如何降低腫瘤細胞生長，實驗會以癌症類幹細胞為模式，持續研究抑制腫瘤生長及轉移的機制。 二.中草藥療法在近幾年被重視，因為以中草藥搭配放射療法能減低癌症病患副作用，提升體質。本實驗以可能具有較高轉移能力及抗藥性的肺癌類幹細胞為模式，研究中藥苦參 (Sophora flavescens) 、鴨膽子 (Brucea javanica)、夏枯草 (Prunella vulgaris) 及西藥teroxirone 如何抑制肺癌類幹細胞生長。本實驗觀察幹細胞表面標誌Nanog，確認肺癌類幹細胞平臺的建立，接續使用螢光顯微鏡觀察幹細胞在這些藥物處理下，H460, H1299/p53及A549肺癌類幹細胞會隨藥物濃度及時間增加，其數目及形狀明顯的變少及變小，表示具有抑制肺癌類幹細胞生長的潛力，最後再以western blot實驗確認teroxirone會誘導H460肺癌類幹細胞走向p53依賴的細胞凋亡路徑。於先前研究中已知夏枯草可降低肝癌細胞的轉移力，苦參及鴨膽子可抑制A549腫瘤生長，此外，低劑量的teroxirone可抑制肺癌細胞生長及誘導細胞凋亡，所以日後將持續以此類模式探討這些藥物是否能抑制肺癌類幹細胞生長以及降低轉移能力。Item 1.鑑定以細胞自噬清除神經母細胞瘤堆積多麩醯胺的小分子化合物 2. 鑑定具有清除肝癌類幹細胞潛力的藥物(2014) 楊采蓁1.多麩醯胺酸疾病多屬於神經退化性疾病，主要原因是因為核苷酸CAG異常重複，讓蛋白質錯誤折疊造成聚集所引起細胞毒性，進一步造成細胞死亡。目前已有報導指出，自噬系統可以透過溶酶體降解突變蛋白、胞器並減輕polyQ聚集所引發的細胞毒性，因此促進細胞自噬也許對於神經退化性疾病的治療能提供一個有效的方向。本研究轉殖不同長度polyQ結合綠色螢光蛋白的基因進入人類神經瘤母細胞建立穩定細胞株作為篩選平台，實驗首先利用螢光染色標定細胞自噬相關標記，篩選出能誘導細胞自噬並且不會影響細胞的存活的化合物。再透過螢光顯微鏡觀察藥物是否可以加強清除蛋白堆積物。此外在西方轉漬法，確定藥物能增加細胞自噬的相關標記蛋白。最後利用自噬抑制劑抑制細胞自噬進而降低清除polyQ聚集蛋白的能力，以證明藥物是透過促進自噬方式清除毒性蛋白堆積物。本研究所篩選的藥物，可作為治療神經退化性疾病的潛力藥物的發展，未來將更進一步確認細胞自噬如何清除細胞polyQ 堆積的相關機制。 2.肝癌是全球排名第三與癌症死亡有關的疾病，雖然手術切除可以提高存活率，但是在術後常發現還是有癌細胞轉移及擴散的現象。癌症幹細胞具有自我更新以及分化能力，認為是造成癌症轉移、復發，對於化療、放射性療法產生抗藥性的主要原因，由於腫瘤細胞亞群可以抵抗藥物毒性導致在癌症病患體內要徹底清除癌細胞是一大挑戰。本論文使用肝細胞株Huh7 (mutant p53)，HepG2 (wild Type p53)和Hep3B (p53 null)分別處理teroxirone以及各種中藥，觀察細胞型態。實驗首先要培養肝癌類幹細胞，將肝癌細胞培養在不含血清但含有特定生長因子的培養基(DMEM/F12)裡面含鹼性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor; bFGF)，表皮生長因子(epidermal growth factor; EGF)以及B27，培養7天後，將培養出tumor sphere，實驗以不同濃度的teroxirone以及中藥處理進一步利用顯微鏡觀察spheroid的生成和大小，並鑑定相關蛋白質變化。目前本研究發現這些藥物會有不同程度降低tumor sphere的體積及數目，會進一步會利用癌症標誌物分離肝癌spheroid的細胞，未來將具有癌症幹細胞特徵的細胞使用萃取緩衝液萃取出蛋白，再利用西方點墨法觀察幹細胞相關標誌物以及可能的細胞凋亡機制，期望本研究可以利用不同藥物以降低肝癌類幹細胞生長以及有效抑制腫瘤的增生。Item 活化p53調控人類非小型肺癌細胞凋亡的藥物與機制(2015) 王景平; Wang, Jing-PingPart I 本論文發現三環化合物 (Teroxirone) 在低濃度下能抑制人類非小型肺癌細胞 (NSCLC cells) 的增生，不論在體外實驗或體內實驗都能具有顯著的效果。藥物所誘發的p53依賴型的細胞凋亡 (p53-dependent apoptosis) 是經由破壞癌細胞內的DNA結構所引發的，讓癌細胞p53上升，進而活化下游caspase-3，導致最終的細胞凋亡。而caspase-3的抑制劑 (DEVD-CHO) 或是利用 si-RNA p53抑制細胞內的p53，皆能抑制藥物所引發的細胞凋亡現象。另外，此藥物在缺失p53的細胞H1299 cells中，也能引起些微的細胞毒性。在體內實驗中，此藥物對於裸鼠身上的癌細胞也具有顯著抑制生長的功效。進一步發現，此藥物會引發癌細胞內的氧化壓力、產生活性氧化物 (ROS)、讓細胞內的粒腺體外膜崩壞，進而產生p53依賴型的內生性細胞凋亡 (intrinsic apoptosis pathway)。而利用ROS的抑制劑 (NAC) 進行處理後，也會抑制藥物所引發的細胞凋亡現象。由結果顯示，此藥物在低濃度時就能引發癌細胞的細胞凋亡並會顯著抑制癌細胞增生的結果，在未來可以是一個具有潛力治療人類非小型肺癌細胞的藥物。 Part II 玫瑰樹鹼 (Ellipticine) 是一種DNA拓樸異構酶II抑制劑，能夠有效的抑制人類非小型肺癌細胞 (NSCLC cells) 的增生。之前研究指出，此藥物能讓p53及Akt活化且共同轉移至細胞核內，並可藉由磷酸化AktS473去誘導癌細胞產生細胞自噬 (autophagy)，進而引發細胞死亡。另外，此藥物也可抑制能穩定表現p53功能的細胞株 (利用轉殖wild-type p53質體進入原本缺失p53的細胞株 (H1299 cells) 內，並讓其穩定表現 p53功能的細胞株) 的生長。在本研究中，我們進一步發現到，將AktS473的磷酸化位點突變成alanine以及利用shRNA p53去knockdown p53後，皆能抑制玫瑰樹鹼對於p53和Akt的活化以及轉移至細胞核內的程度，也能同時減少細胞凋亡的產生。因此，p53能夠讓此誘導細胞凋亡，並且能協助磷酸化AktS473進入細胞核內，進而引發細胞自噬作用，導致細胞死亡。本研究指出，玫瑰樹鹼能活化p53及磷酸化AktS473，並藉由這兩者間的協同作用去抑制癌細胞的生長。對於原本只有DNA拓樸異構酶II抑制功能的藥物，能提供另一個治療癌症抑制的新思維。Item 探討三環藥物Teroxirone及吲哚基喹嚀藥物抑制人類非小細胞肺癌類幹細胞增生的機制(2016) 倪玉玲; Ni, Yu-Ling先前研究結果顯示三環衍生物teroxirone (1, 3, 5-triazine-2, 4, 6 (1H, 3H, 5H)-tri-one-1, 3, 5-tri-(oxiranylmethyl))及吲哚基喹嚀藥物EMMQ (3-((7-ethyl-1H-indol-3-yl)-methyl)-2-methylquinoline)具有抑制人類非小細胞肺癌生長的效果，雖然它的反應機制是透過細胞凋亡，然而卻因為殘存的癌幹細胞阻礙了藥物的完整活性。所以本論文的主要目的是想透過肺癌類幹細胞的培養模式探討teroxirone及EMMQ是否能夠根除潛在的肺癌幹細胞。首先須建立無血清以及低貼附性的特殊環境培養出肺癌類幹細胞球再進行後續的實驗。利用BrdU螢光染色和soft agar assay發現teroxirone與EMMQ可以抑制球狀細胞的生長、數量以及形成群落的能力。而以內差法計算soft agar assay的結果顯示，肺癌類幹細胞球所需的IC50遠高於貼附性細胞先前於MTT assay結果中所需的IC50，證明肺癌類幹細胞球確實具有較高的抗藥性。次以反轉錄聚合酶連鎖反應、西方墨點法及免疫螢光染色法證實teroxirone和EMMQ抑制肺癌類幹細胞的自我更新能力相關的幹細胞標誌基因，例如Nanog和ALDH1A1等。此外，TUNEL assay和西方墨點法的結果也顯示，teroxirone及EMMQ會誘發球狀細胞產生凋亡，最後以裸鼠皮下注射之腫瘤異種移植模式探討EMMQ之治療效果。根據論文的結論，teroxirone與EMMQ除了可以抑制貼附性肺癌細胞生長，若能適當地提高濃度也可以藉由細胞凋亡清除肺癌幹細胞。Item 探討三環藥物Teroxirone抑制肝癌細胞生長的機制(2016) 王文興; Wang, Wen-Hsing肝癌在全球癌症致死率排名第二，而肝內轉移途徑是造成肝癌復發與高死亡率的主要原因之一。但肝癌轉移機制仍不清楚。三環氧化物triptolide的衍生物teroxirone為一合成的抗癌試劑，過去研究發現teroxirone會使人類非小細胞肺癌細胞經內源性途徑細胞凋亡。本篇使用常見的肝癌細胞株Huh7 (具有突變p53)、HepG2 (野生型p53)與Hep3B (無p53)進行實驗，實驗顯示teroxirone會使肝癌細胞株Huh7產生外源性途徑細胞凋亡。進一步使用caspase-3抑制劑Z-DEVD-FMK來確認teroxirone所誘導Huh7產生細胞凋亡是否透過外源性途徑，發現細胞在加藥前經過caspase-3抑制劑處理，外源性細胞凋亡相關的蛋白質表現降低。另外，透過傷口癒合檢測 (wound-healing assay)與細胞遷移與侵入實驗 (transwell migration and invasion assay)都顯示藥物濃度低於IC50的teroxirone處理可以抑制Huh7產生細胞遷移與侵入。而利用酶譜分析 (zymography)與西方墨點法 (western blot)之結果可看出在低濃度的teroxirone處理後促進細胞轉移相關的蛋白基因表現皆有受到抑制。此外，證明了teroxirone會去降低Huh7 stem-like cells增生與其幹細胞指標。在動物模式中，異體移植的Huh7腫瘤teroxirone處理，會使腫瘤透過細胞凋亡的方式達到抑制腫瘤生長的目的。結論，teroxirone會透過活化外源性細胞凋亡途徑抑制人類肝癌細胞的生長，且低濃度的藥物處理能抑制肝癌細胞的遷移與轉移。另外，teroxirone能降低肝癌類幹細胞的幹細胞特性，並抑制動物模式中異體移植之腫瘤生長，顯示teroxirone在治療肝癌具有發展潛力。Item 建立人類非小型細胞肺癌之癌幹細胞對藥物的篩選平台(2015) 范柏緯; Fan, Po-Wei本實驗以肺癌類幹細胞為模式研究 teroxirone 與中草藥抑制細胞生長的效果。之前研究已經知道低劑量的 teroxirone 具有抑制人類非小細胞肺癌 (NSCLC) 細胞生長之效果，在這次實驗中利用 BrdU assay 、反轉錄聚合酶連鎖反應、西方墨點法及 TUNEL assay 證實此藥物會藉由引起細胞凋亡而抑制 NSCLC 細胞之癌類幹細胞的生長，並且會抑制幹細胞標記分子的表現。另一部分，已經有報告指出多種中草藥具有抗癌效力，而本實驗篩選出中草藥 A 可以抑制 H1975 (EGFR 雙重突變的肺癌細胞株) 貼附型細胞及癌類幹細胞的生長，利用流式細胞儀、反轉錄聚合酶連鎖反應及西方墨點法證實此中藥會誘使 H1975 細胞凋亡，並且也會抑制幹細胞標記分子的表現。