學位論文
Permanent URI for this collectionhttp://rportal.lib.ntnu.edu.tw/handle/20.500.12235/73908
Browse
14 results
Search Results
Item 利用斑馬魚胚胎模式研究烯酸酯類殺菌劑pyraclostrobin 之毒性(2023) 葉凡瑄; Yeh, Fan-Hsuan百克敏(pyraclostrobin)是一種被大量使用的農業除真菌劑，透過地表徑流等途徑汙染環境，在世界各地的水域已被檢出。其對於水生生物包括魚類以及兩棲類，具有極高的非專一毒性。先前研究證實百克敏對於斑馬魚具有粒線體毒性、心毒性並造成發育延遲、增加氧化壓力、降低活動力。但對魚類其他生理功能的影響仍不清楚。本研究利用斑馬魚胚胎作爲毒理模式，將其曝露於100-1000 ppb的百克敏96小時後，觀察其對於基因表現、離子調節、側線感覺功能的變化；曝露百克敏120小時後，觀察聽覺與視覺行爲的改變。並利用轉基因螢光魚觀察中樞神經系統的影響。結果顯示百克敏96小時半致死濃度為204.6 ppb。濃度≥100 ppb 造成心率下降、側線毛細胞損傷、觸碰逃跑速度下降；濃度≥150 ppb造成體長降低，眼睛、耳石囊、耳石面積變小，卵黃消耗減少，體内Ca2+、K+離子含量下降，離子細胞數目減少；濃度200 ppb造成圍心腔水腫、皮膚幹細胞減少以及側線毛細胞減少。利用RNA定序分析基因表現發現許多異常包括:離子調節(atp1a1a, atp2b,atp6v, kcnj1a, rhcg)、側線感覺(cib2, myo6b, s100)、粒線體電子傳遞鏈(cytb, cox3、cox19)、內耳感覺(otomp, cep290, oc90)、視覺(cabp5a, clcc1)、細胞凋亡(casp3, casp8, casp17)等相關基因。在行為實驗發現，百克敏會降低聲音驚嚇反應之敏感度，並延長視覺運動反應時間。螢光魚的結果顯示，百克敏會造成脊髓運動神經元減少。綜上所述，本研究提出百克敏可能會造成魚類離子調節、周邊感覺(側線、視覺、聽覺)以及中樞神經異常，對魚類生存造成威脅，需更審慎評估百克敏的使用。Item 芬普尼及酸性水的暴露對於斑馬魚胚胎發育及離子調節之影響(2022) 彭元廷; Peng, Yuan-Ting人類活動引發的淡水酸化已成為全球性的問題，並且已對水生動物構成嚴重的威脅，而酸性水可能會增加水中污染物對水生動物的毒性。芬普尼 (fipronil)是一種苯基吡唑類殺蟲劑，目前廣泛使用於農業活動和寵物用藥。先前的研究表明，芬普尼的殘留物會對魚類造成多種毒性作用。然而，目前尚不清楚芬普尼是否會損害魚類的離子調節及酸化水是否會增強芬普尼的毒性。在這項研究中，斑馬魚胚胎被當成模式動物來回答這些問題。從受精後 4 小時開始，斑馬魚胚胎暴露在不同濃度 (0、0.1、0.5、1、5 和 10 ppm)的芬普尼中 96 小時。芬普尼以劑量依賴性的方式增加死亡率並延遲孵化。 芬普尼 (≧ 1 ppm) 的毒性亦使得身體及肌節的長度、眼睛、耳石囊和嗅窩的面積都與控制組相比呈現下降。此外，芬普尼還降低了側線毛細胞及皮膚離子細胞 (包括 HR 細胞和 NaR 細胞)的數量以及相關的離子調節功能。在酸性水 (pH5) 中，芬普尼導致離子細胞酸分泌的功能更嚴重地下降。這項研究首次表明芬普尼可以損傷皮膚離子細胞並威脅魚類在酸性環境中的生存。Item 銀離子對廣鹽性青鱂魚胚胎離子調節與海水適應能力之影響(2022) 李亞珊; Lee, Ya-Shan銀被廣泛應用於商業產品與醫療器材中，例如：抗菌劑、個人護理產品、傷口的敷料……等。隨著銀的廣泛使用，此類化學物質對水生環境的潛在負面影響也日漸受到重視。過去文獻指出，銀離子暴露會干擾魚類離子調節的功能、損害魚類的肝臟、鰓、腸子等器官與造成胚胎發育毒性，但針對銀是否會影響廣鹽性魚類適應環境鹽度轉變的能力，相關研究較為少見。本研究利用青鱂魚（Oryzias latipes）胚胎作為模式動物，更全面性地探討銀離子在淡水與海水中對廣鹽性魚類離子與滲透壓調節的影響。硝酸銀暴露7天後，淡水與海水馴養組的半致死濃度分別為0.17 ppm與1.01ppm。淡水馴養組的胚胎心率顯著上升、以NKA免疫細胞螢光染色標定的離子細胞密度顯著下降，而海水處理組則是沒有顯著變化。將胚胎暴露於含有硝酸銀的海水8天後，發現胚胎的相對喝水量顯著下降、腸道細胞的凋亡程度顯著上升，還可觀察到腸道組織與上皮細胞受損。將胚胎暴露於含有硝酸銀（0.01、0.05、0.1 ppm）的淡水7天後，轉移至含有相同硝酸銀濃度的海水中12小時，並評估銀離子對胚胎的海水適應能力之影響。結果顯示，胚胎的死亡率顯著上升、心率顯著下降，形態方面則觀察到體軸彎曲、軀幹脫水與圍心腔水腫。離子調節方面，以NKA免疫系標染色所標定的離子細胞形態變形且細胞密度顯著下降、以MitoTracker標定的卵黃囊上具粒線體活性的離子細胞之細胞密度下降、頂膜開口的大小沒有產生適應性變化，顯示離子細胞受損且可能無法轉為海水型。此外，硝酸銀暴露還會使胚胎轉移至海水後的相對喝水量顯著下降。由於離子與滲透壓調節器官的功能受損，最後導致胚胎體內鈉離子含量顯著上升。綜合以上結果，可知銀離子毒性在淡水環境下比海水環境下強，且在淡水中會造成卵黃囊上的離子細胞損傷，而在海水中則會造成腸道組織與細胞受損並降低吸收水分的能力。當離子與滲透壓調節器官受影響時，胚胎亦無法成功適應環境鹽度的改變。Item 聚苯乙烯奈米塑膠顆粒在海水或淡水中的毒性差異及加上二苯甲酮-3共處理後在海水中對青鱂魚的影響(2022) 邱旭證; Qiu, Xu-Zheng隨著科技的發展，塑膠製品的大量使用造成環境中越來越嚴重的塑膠污染已在近年成為人們關注的重大問題。另一項受到眾人矚目的汙染源則是市售防曬乳中常見的化學添加物:二苯酮家族，其中又以二苯甲酮-3（Benzophenone-3, BP-3）的防曬效果最好，但其毒性也最大。不管是塑膠垃圾分解後形成的塑膠顆粒或是BP-3等添加物，對於海洋的影響都最為深遠，但現行研究多半著重於兩者對淡水脊椎生物的影響，針對海水脊椎動物的研究數量卻是遠遠不及。有鑑於此，本研究選擇青鱂魚（Oryzias latipes）作為本研究的模式動物，利用青鱂魚的廣鹽性，比較聚苯乙烯奈米塑膠顆粒（Polystyrene nanoplastic particles, PS-NPs）在海水中和淡水中是否會對魚類造成不同程度或不同類型的傷害。除此之外本研究也針對海水環境分別測試PS-NPs和BP-3以及在共處理情況下這些物質對胚胎早期發育的影響。首先，我們使用了0、10、25和50 ppm四種不同濃度的PS-NPs處理，分別在海水及淡水環境下進行實驗，結果顯示在海水環境50 ppm組別中發現死亡率有顯著上升，且海水處理下的25和50 ppm組別中發現，樣本的表皮離子細胞數目有顯著減少，細胞分泌的氫離子和氯離子也被抑制。淡水處理下則是在25和50 ppm組別中觀察到樣本的側線毛細胞數量顯著減少，同時在25 ppm組別中觀察到胚胎的活動力下降。而BP-3的實驗，我們將胚胎暴露在含0、0.005 % DMSO、1、3和5 ppm BP-3的海水中，結果顯示在含有BP-3的海水中暴露8天後，雖然不會造成胚胎死亡，但3 ppm和5 ppm處理組在個體長度等早期發育指標及離子細胞、毛細胞數量上有顯著下降。在共處理的情況下，則是透過控制組、3 ppm BP-3、25 ppm PS-NPs及3 ppm BP-3加上25 ppm PS-NPs的共處理組互相比較，我們發現和單純暴露於BP-3的組別相比，共處理組中兩個變因對胚胎的影響反而變小。總結以上結果，PS-NPs在淡水與海水中會呈現不同強度或不同面向的傷害；BP-3則會造成發育遲緩和離子細胞、毛細胞的數量下降；但共處理後，BP-3因受到PS-NPs的影響，毒性會減弱。Item 氨暴露導致斑馬魚胚胎離子調節損傷及成魚行為改變(2021) 鄭倢安; Cheng, Chieh-An氨（包含氣態的NH3以及離子態的NH4+）為魚類代謝胺基酸後產生的主要含氮廢物，也是常見的環境汙染物。當魚體內氨濃度提高，將會導致魚隻中樞神經受損，抽搐、昏迷甚至死亡。然而，目前研究中多著重在高氨處理後魚類的適應機制，關於氨對魚隻離子調節功能及行為的毒性作用尚不清楚。本研究分為兩個部分，首先利用斑馬魚胚胎作為模式動物，探討氨如何對胚胎離子調節功能造成損傷，接著利用斑馬魚成魚作為模式動物，評估氨處理後斑馬魚的行為改變。在胚胎毒性研究中，浸泡於不同濃度（0、10、15、20 mM）的氯化銨溶液中96小時（4-100 hpf）後，觀察胚胎卵黃囊上離子細胞及表皮角質細胞。結果指出，20 mM氨處理後離子細胞內氧化壓力上升（CellROX螢光亮度顯著上升）且由Rhodamine 123標定的具粒線體活性離子細胞數目顯著下降，顯示粒線體活性降低。此外，以細胞免疫螢光染色標定20 mM氨處理後凋亡細胞數目顯著上升，並觀察到表皮角質細胞結構損傷。綜合以上結果發現，在高氨處理下，斑馬魚胚胎離子細胞及表皮角質細胞損傷，導致斑馬魚胚胎失去體表屏障，體內離子大量流失。而在行為實驗中，將斑馬魚浸泡於不同濃度（0、1、5、10 mM）的氯化銨溶液中4小時後，對游泳行為、社交行為、學習與記憶能力等面向進行不同實驗。結果顯示1 mM氨處理時可以促進學習記憶能力；5 mM時焦慮及恐懼程度提升且群游下降；10 mM氨處理時活動力、社交行為及焦慮程度下降，但恐懼程度上升。綜上所述，在不同濃度氨暴露以及不同的環境刺激下，斑馬魚的游泳、社交、學習等行為改變，而這些改變可能使斑馬魚存活率下降，進一步使個體適存度降低。Item 順鉑導致斑馬魚胚胎離子細胞氧化壓力與細胞凋亡(2020) 吳巧羚; Wu, Ciao-Ling順鉑為現今廣泛使用之化療藥物，卻伴隨腎毒性、神經毒性和耳毒性等副作用，其中主要限制施予劑量的因素為腎毒性。順鉑可經由銅離子運輸蛋白與有機陽離子運輸蛋白進入腎臟上皮細胞，造成腎小管損傷，目前哺乳動物細胞研究模式已知氧化壓力生成是順鉑造成細胞損傷的主要原因之一。斑馬魚是廣泛使用於毒理學研究與藥物測試的模式動物，其仔魚表皮分布的五型離子細胞與哺乳動物腎臟上皮細胞有許多相似之處，因直接暴露於環境，好操作且易觀察。本研究以斑馬魚仔魚表皮離子細胞作為研究順鉑腎毒性之工具，使用活體螢光染色觀察順鉑對離子細胞的影響，來證實順鉑會導致離子細胞氧化壓力生成、粒線體損傷和細胞凋亡。本實驗將斑馬魚胚胎浸泡於不同濃度的順鉑（0、50、100、300、500 或 1000 μM）進行長時間（4-100 hpf）或短時間（96-98 hpf）處理，再使用活體螢光染劑單染或共染的方式，標定斑馬魚仔魚卵黃囊上具粒線體活性離子細胞（Rhodamine 123/MitoTracker）與凋亡細胞（AcridineOrange），並探討當中活性氧化物的產生（CellROX/ MitoSOX）。斑馬魚胚胎分別在順鉑處理 96小時及 2 小時後，Rhodamine 123 標定具粒線體活性離子細胞數目均顯著下降，且凋亡細胞數目顯著上升；斑馬魚胚胎分別在順鉑處理 96 小時及 1 小時後，產生活性氧化物的離子細胞數目或 CellROX/MitoSOX 的螢光亮度均顯著上升。此外，將斑馬魚胚胎進行抗氧化劑 NAC（0、100、300、500 或 1000 μM）與順鉑的長時間共處理，發現 NAC 能降低胚胎的死亡率，並減緩順鉑對離子細胞所導致的氧化壓力與損害。由以上結果可證實順鉑會導致離子細胞氧化壓力生成和粒線體損傷，並引起細胞凋亡，而抗氧化劑 NAC 可作為順鉑毒性的保護劑。Item 青鱂魚仔魚在鹽度適應過程之離子細胞功能研究–離子細胞功能之可塑性(2010) 沈婉萍; Wan-Ping Shen魚類鰓上富含粒線體的細胞 ( mitochondrion-rich cells , MRCs ) 被認為是具有離子調節功能的細胞，在海水的環境中，這類細胞負責將過多的離子由魚體內排出至外界環境中，在淡水下則是負責離子吸收的功能。在海水中，Cl-主要是由MRCs的頂膜排出 ; 而Na+被認為由MRCs與輔助細胞 ( accessory cells , ACs ) 間形成的不緊密的細胞間隙擴散排出。前人研究發現在鹽度適應過程中，MRCs能持續存在於鹽度適應的過程，顯示MRCs可能進行功能轉變以因應鹽度轉變。然而，這些MRCs是否能夠直接在淡水型與海水型功能間轉換仍缺乏直接的證據。因此本研究目的是提出細胞功能轉變的直接證據，並探討在淡、海水轉移中MRCs型態與功能轉變間的相互關係。利用掃描式離子選擇電極(SIET)在青鱂魚仔魚表皮上分析MRCs的Na, Cl運送與型態變化。結果發現，在海水馴養下的青鱂魚仔魚體表可觀察到兩類型的MRCs : ( 一 ) 單一存在具有明顯對外開口的MRCs ( single-mitochondrion-rich cells, s-MRCs ) ; ( 二 ) 由AC與1~2顆 MRCs組成的多細胞複合體型態 (multicellular complex-mitochondrion-rich cells, mc-MRCs)。在有AC伴隨的MRCs的開口上，有明顯較高的Na+、Cl-排出; 無AC伴隨的s-MRCs開口上只有明顯的Cl-排出，無明顯的Na+排出，證明AC確實對排Na+扮演重要功能。此外，隨著適應的鹽度提昇，mc-MRCs出現比例會提高。利用SIET測量仔魚體表的Na+, Cl-濃度梯度變化，發現仔魚由淡水轉移至海水過程中，在轉移3小時內Na+呈現吸收，隨後逐漸轉為排出，至第5小時後達到與海水控制組相同的量，而Cl-排放在轉移後2小時即快速達到與海水適應組相同的量，顯示海水適應過程中Cl- 調節比Na+ 調節快。此外，由海水轉移至淡水過程中，在轉移30分鐘內，體表Na+, Cl-排出即快速降低至與淡水適應組相同的程度。在單一MRCs上測量Na+, Cl-離子流(ionic flux)發現，由海水轉移至淡水3-5分鐘內，MRCs 上Na+的排出量快速降低至原本的2-3 %以下，顯示出MRCs快速的調節能力。而利用活體的連續觀測方式，追蹤mc-MRCs及s-MRCs在海水轉移至淡水環境後，發現MRCs的開口有逐漸變大的現象。此外，mc-MRCs的AC會逐漸遠離MRC開口。本實驗直接證明海水型MRCs能夠在淡水適應過程中，直接轉變為淡水型的MRCs。Item 青鱂魚海水型離子細胞之排氨、排鹽以及酸鹼平衡機制研究(2015) 劉咸台; Liu, Sian-Tai海水硬骨魚皮膚或鰓上的離子細胞主要負責排氨、排酸以及排鹽等功能。過去研究認為酸促進氨排放的機制對於淡水魚排氨相當重要。然而，酸促進氨排放的機制對於海水魚排氨的重要性至今仍未清楚。除此之外，離子細胞的排酸機制在海水魚的研究中也尚未釐清。本研究的目的是利用廣鹽性物種青鱂魚為模式，用來釐清海水魚離子細胞的排氨、排鹽以及酸鹼平衡機制。 在第一章利用選擇性離子掃秒電極的電生理技術來偵測仔魚體表的氫離子濃度梯度，發現海水青鱂魚卵黃囊體表的區域有酸性層的存在。卵黃囊體表的離子細胞其排氫的能力比角質細胞佳。在Tricine buffer和EIPA藥物處理後發現仔魚體表的排酸和排銨皆明顯的下降。藉由原位雜交反應以及化學免疫染色的方式標定出Na+/H+ exchanger 2 (NHE2) mRNA和NHE3蛋白皆表現在同一型海水離子細胞上。經定量即時聚合酶鏈鎖反應分析中發現青鱂魚鰓上的NHE3、Rhesus B glycoprotein (Rhbg)、Rhcg1和Rhcg2的mRNA在海水馴養後表現量下降，NHE2則是表現量上升。然而，在高銨海水馴養後青鱂魚鰓上的NHE3、Rhbg、Rhcg1和Rhcg2的mRNA表現量皆上升。這些發現證實海水型離子細胞同時具有排酸以及排氨的能力，藉由離子細胞的NHE和Rh蛋白來參與酸促進氨排放的排氨機制。 在第二章將利用電生理技術測量海水青鱂魚仔魚體表離子細胞的氫和氯離子排放量。在NHE、Carbonic anhydrase (CA)、anion exchanger (AE)蛋白的抑制劑處理後發現離子細胞的排氫和排氯皆明顯下降。在短期CO2馴養後會同時刺激離子細胞酸和氯的排放量。透過原位雜交反應和化學免疫染色的方式定位CA2和AE1皆表現在同一型海水離子細胞上。青鱂魚鰓上的Na+/K+/2Cl- cotransporter (NKCC1a)、CA2和AE1 的mRNA在海水馴養後皆上升。另外，在酸化的海水馴養後鰓上的AE1a和AE1b 的mRNA皆上升；而NKCC1a則是在鹼化的海水馴養後上升。這些結果解釋海水魚離子細胞的排酸機制並重新定義過去所建立的排氯機制。 在第三章我們將近一步的探討NHE2蛋白在海水型離子細胞的酸鹼平衡和排鹽功能。在抑制NHE2蛋白質表現後離子細胞的排酸和排氯皆明顯的下降，說明NHE2參與了海水型離子細胞的酸鹼平衡和排鹽功能。綜合這些結果，我們解釋海水型離子細胞的排氨、排鹽以及酸鹼平衡機制並且發現這些機制彼此間的是有關聯性的。Item 以斑馬魚為模式調查環境酸化與鉑類化療藥物對毛細胞與離子細胞的影響(2019) 洪君儀; Hung, Giun-Yi淡水生態系統的酸化已被認為是全球性的環境問題，並導致魚類行為的變化。然而，酸性環境是否造成淡水魚側線系統的功能改變仍然是未知的。此外，許多研究揭露藥物汙染水環境的事實，其中包括抗癌化療藥物。然而這些藥物造成的環境作用、環境影響的程度與廣度鮮為人知。本研究目的在於檢視斑馬魚胚胎暴露於酸性或鹼性淡水時，是否改變了神經丘毛細胞的表達和功能。並藉由決定鉑類化療藥物(順鉑)對於表皮離子細胞與毛細胞產生影響之最小濃度，了解順鉑之亞致死效應，以應用於鉑類藥物造成水環境影響之早期風險評估。將斑馬魚胚胎暴露於不同的酸鹼pH值環境中，分析長期暴露(受精後0~96小時)與短期暴露(受精後48~96小時)對胚胎形態與側線毛細胞功能之影響。另外，將斑馬魚胚胎受精後長期暴露於不同濃度的順鉑後，分析胚胎形態、存活率、體長、及魚體的離子(鈉、氯、鈣)與鉑含量。功能分析方面，利用掃描式離子選擇電極，分析側線毛細胞功能(機械傳導通道鈣離子流)與皮膚離子細胞排酸功能。結果顯示，長期暴露於pH5條件下，側線毛細胞數量與功能皆下降。短期暴露於pH5條件下，僅毛細胞功能下降，然而毛細胞數目不變。進一步利用morpholino oligonucleotides進行基因減弱，降低H+-ATPase與 gcm2 表現，使得調節酸鹼平衡機制受損後，發現胚胎毛細胞數量與功能皆下降。此外，胚胎長期暴露於濃度由低至高的順鉑中，毛細胞功能最先受損(濃度1 µM)、隨後是毛細胞數與魚體氯離子含量下降(濃度10 µM)、離子細胞排酸能力下降及魚體鈉與鈣離子含量下降(濃度50 µM)、體長與離子細胞密度下降(100 µM)、最後是存活率下降(濃度500 µM)。研究結果顯示酸性環境會導致神經丘毛細胞功能受損。對於順鉑引起之毒性，毛細胞明顯比離子細胞更敏感。本研究利用掃描式離子選擇電極偵測毛細胞與離子細胞功能之改變，決定順鉑最低影響濃度，此法有高達500倍相較於偵測存活率變化之敏感度，未來可應用於偵測鉑類藥物對於水環境造成之早期風險評估。Item 奈米金屬顆粒對廣鹽性青鱂魚離子細胞,毛細胞以及行為的毒性(2019) 傅至偉; Fu, Chih-Wei含有奈米顆粒產品的廣泛使用，隨之產生的毒性也越受到關注，目前研究指出奈米顆粒進到環境中可能對生物造成危害。然而奈米顆粒在海水環境中對魚類的行為與生理功能的影響仍未被研究的很透徹。在本實驗中利用淡水跟海水馴養的青鱂魚(Oryzias latipes)仔魚進行奈米銀與奈米銅顆粒的毒性實驗，將馴養7天剛孵出來的仔魚浸泡在含有奈米顆粒 (0.1, 1, 10 ppm) 的水中四小時，然後分析仔魚的活動力、刺激游泳反應、側線毛細胞數目、離子細胞數目以及皮膚排酸量。在淡水組的實驗中發現奈米銀顆粒處理後，仔魚活動力顯著下降，毛細胞數目、離子細胞數目和皮膚排酸量也顯著下降，最大游泳速度與最大游泳加速度並沒有受到影響。奈米銅顆粒溶液浸泡後發現仔魚的毛細胞數目、離子細胞數目和皮膚排酸量顯著下降，游泳距離、最大游泳速度以及最大游泳加速度則發現在低濃度上升，高濃度下降的趨勢。在海水組的實驗發現，奈米銀顆粒處理後只有發現仔魚活動力以及排酸量下降。奈米銅顆粒處理後只有活動力下降而其他實驗則無統計差異。結果顯示在海水環境中奈米顆粒毒性較在淡水環境低。此外硝酸銀與硫酸銅進行毒性試驗也出現類似的毒性反應。