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Item 探討漸進式熱預處理以及缺血預處理於大鼠心肌缺血再灌流損傷之保護作用(2022) 陳玥希; Chen, Yueh-Hsi缺血性心臟病是世界主要致死原因之一。當冠狀動脈遭到堵塞時，產生急性心肌梗塞，導致血管下游組織缺血、供氧減少而促使心臟組織走向死亡。對於這樣的清況，公認的治療方法為通過原發性冠狀動脈介入治療來恢復血流使其恢復含氧。然而，恢復含氧血流卻相反地會誘導心肌細胞死亡並增加梗死面積，從而降低其效益，這便是所謂的缺血/再灌流損傷。心肌可以藉由預處理、後處理和藥物預處理達到保護效果。全身性的漸進式熱預處理(PTP)可能具有產生抗氧化壓力的心臟保護作用，可有效減少細胞凋亡，並降低缺血/再灌流損傷的情形。在缺血預處理(IPC)的部分，長期缺血前給予短時間的缺血處理已被公認為有效預防缺血/再灌流損傷的心臟保護機制之一。熱預處理和缺血預處理這兩種不同的預處理類型都可以提供心血管保護，任何一種應用都可以在心肌I/R損傷後保持心臟微血管的功能和結構完整性。然而，在 PTP 中更有效的保護作用仍有待探索，例如三重漸進式熱預處理 (3PTP)，它能夠提供比單一熱預處理更有效的心血管保護，並可能維持缺血/再灌流損傷後心臟微血管的功能和結構完整性。與細胞凋亡、自噬、壞死等其他形式的細胞死亡不同，依賴鐵的程序性細胞死亡是一種新型的細胞死亡方式，也是包含心血管疾病、I/R 損傷等疾病研究的新指標。在本次研究中，我們應用了兩種不同類型的預處理，3PTP 和 IPC分別來保護心臟功能，旨在研究它們對心臟 I/R 中心肌結構、細胞凋亡、炎症和鐵凋亡的保護機制。在心肌缺血/再灌流損傷模型當中，大鼠通過閉塞冠狀動脈左前降支使其經歷60分鐘的缺血然後疏通血管再灌注240分鐘，並同時檢測血流動力學參數，包括心電圖、微循環、心率、左心室舒張末期壓、心室腔內壓力的心室血壓的最大上升速率 (+dp/dt) 和血壓最大下降速率 (-dp/dt)。心肌梗塞的大小通過 Evans blue-TTC 染色方式檢測。通過西方墨點法和組織免疫染色確定預處理誘導的生化保護機制。在我的結果中顯示心肌缺血/再灌流會抑制心臟的微循環，誘導心電圖 S-T 段升高，增加鐵依賴性細胞死亡模式發生、紅血球聚集、白細胞和巨噬細胞/單核細胞浸潤、梗塞面積增加、白血球生長因子和TUNEL檢測的陽性反應增加。而在接受預處理的保護方法後能產生抵抗心肌缺血/再灌流傷害的心臟保護效果，包含+dp/dt的數值回升，左心室舒張末期壓改善，紅血球、白血球浸潤現象和TUNEL檢測的陽性反應減低，心臟組織破碎化和梗塞面積降低，以及鐵依賴性細胞死亡指標蛋白減少。總言之，本研究確定了 IPC在 I/R 誘導的心臟損傷的情況下，能提供對抗鐵依賴性細胞死亡的心臟保護作用。以及，經過改良的 3PTP 可能通過 Bag3 介導的受損心臟結構和功能完整性的保護機制，對 I/R 損傷的心臟提供了防禦效果。因此可認為，三階段式熱預處理(3PTP)及缺血預處理(IPC)的治療方式能減輕心肌缺血/再灌流傷害下的左心室結構惡化和功能障礙。Item 深層海水對急性腸胃炎的預防及治療功效之探討(2021) 李冠葦; Li, Guan-Wei腸胃道是人體進行食物消化與養分吸收最主要的位置，在維持身體正常運作中扮演重要角色。除幽門螺旋桿菌感染外，不良生活習慣、不當用藥、壓力累積等導致胃潰瘍產生，反覆患病且未改善，則易導致胃出血、胃穿孔，甚至罹患胃癌。另一方面，潰瘍性結腸炎是一種自發性結腸黏膜慢性炎症，當前療法不易根治且易復發，近年亞洲各國患病率逐年增加，長期患潰瘍性結腸炎容易讓腸黏膜發育不全，也會使罹癌風險增加。對生活步調緊湊的社會而言，如何有效緩解、控制胃潰瘍及潰瘍性結腸炎症狀、降低發病率並有效治療是重要的研究議題。深層海水得自海平面200公尺以下富含各種離子與高生物活性的有機成分之低溫、乾淨穩定的無污染水。先前研究顯示，深層海水中的部分物質具有清除活性氧物質之功效且能抑制十二指腸潰瘍與細胞凋亡，本研究欲探討飲用深層海水的保護特性，降低胃潰瘍與結腸發炎反應，緩和急性胃腸發炎病狀。實驗結果顯示，深層海水能減少因潰瘍產生的自由基、透過抑制p38與NF-κB活化降低發炎反應、調節P2X7相關路徑減緩細胞凋亡，具抗氧化、抗炎、抗凋亡之功效。Item 氨暴露導致斑馬魚胚胎離子調節損傷及成魚行為改變(2021) 鄭倢安; Cheng, Chieh-An氨（包含氣態的NH3以及離子態的NH4+）為魚類代謝胺基酸後產生的主要含氮廢物，也是常見的環境汙染物。當魚體內氨濃度提高，將會導致魚隻中樞神經受損，抽搐、昏迷甚至死亡。然而，目前研究中多著重在高氨處理後魚類的適應機制，關於氨對魚隻離子調節功能及行為的毒性作用尚不清楚。本研究分為兩個部分，首先利用斑馬魚胚胎作為模式動物，探討氨如何對胚胎離子調節功能造成損傷，接著利用斑馬魚成魚作為模式動物，評估氨處理後斑馬魚的行為改變。在胚胎毒性研究中，浸泡於不同濃度（0、10、15、20 mM）的氯化銨溶液中96小時（4-100 hpf）後，觀察胚胎卵黃囊上離子細胞及表皮角質細胞。結果指出，20 mM氨處理後離子細胞內氧化壓力上升（CellROX螢光亮度顯著上升）且由Rhodamine 123標定的具粒線體活性離子細胞數目顯著下降，顯示粒線體活性降低。此外，以細胞免疫螢光染色標定20 mM氨處理後凋亡細胞數目顯著上升，並觀察到表皮角質細胞結構損傷。綜合以上結果發現，在高氨處理下，斑馬魚胚胎離子細胞及表皮角質細胞損傷，導致斑馬魚胚胎失去體表屏障，體內離子大量流失。而在行為實驗中，將斑馬魚浸泡於不同濃度（0、1、5、10 mM）的氯化銨溶液中4小時後，對游泳行為、社交行為、學習與記憶能力等面向進行不同實驗。結果顯示1 mM氨處理時可以促進學習記憶能力；5 mM時焦慮及恐懼程度提升且群游下降；10 mM氨處理時活動力、社交行為及焦慮程度下降，但恐懼程度上升。綜上所述，在不同濃度氨暴露以及不同的環境刺激下，斑馬魚的游泳、社交、學習等行為改變，而這些改變可能使斑馬魚存活率下降，進一步使個體適存度降低。Item 以第十七型脊髓小腦運動失調症小鼠模式探討ERK活化與Purkinje神經細胞退化之相關性(2020) 林佳薇; Lin, Chia-Wei脊髓小腦共濟失調第十七型（SCA17）是常染色體顯性遺傳小腦共濟失調的一種亞型，是由TATA結合蛋白（TBP）基因中CAG / CAA重複序列的異常擴展所引起。SCA17的臨床特徵是漸進性共濟失調、痙攣、舞蹈症、類帕金森症和認知障礙。而於神經病理上，以小腦萎縮、Purkinje細胞丟失和神經膠質增生為SCA17疾病常見之特徵，並且最終導致共濟失調和行為障礙。實驗室先前已經建立了SCA17轉基因小鼠，以研究異常的TBP聚集體如何誘導SCA17病理作用。在這項研究中，我們主要分析了4-8周大的小鼠，即疾病發作的起始年齡。 我們發現在4週齡大SCA17轉殖基因小鼠中，出現了Purkinje細胞減少，Purkinje細胞核中出現TBP蛋白的累積和小膠質細胞活化。研究尚發現自6週齡大SCA17轉殖基因小鼠，開始發生Purkinje細胞退化情況，亦同時出現星形膠質和Bergmann膠質細胞的增生，並且觀察到在增生的星形膠質細胞和Bergmann膠質細胞中， ERK有被顯著活化之現象。而6週齡大的SCA17轉基因小鼠，也表現出步態紊亂與運動不協調的情況。進一步確認Purkinje細胞死亡的分子機制，6週和8週齡大的SCA17轉基因小鼠中，Bax / Bcl2比例，活化態的caspase-3和89 kD片段的PARP都有顯著增加。綜和上述，SCA17小鼠自6週齡開始，步態異常及運動不協調的表現與神經病理發病的機制在時序上是相呼應的。我們的研究表明活化的pERK是存在星形膠質細胞和Bergmann膠質細胞中，並且可能導致SCA17小鼠小腦神經發炎現象及神經元凋亡。 此外，我們篩選出了一種GSK3β潛力抑制劑PHA-767491，也已知是一種Cdc7 / CDK抑制劑。我們發現PHA-767491透過抑制神經炎症機制對蛋白質聚集相關疾病，如AD、SCA17各種模式均產生了神經保護作用。在SCA17小腦初代細胞培養和器官切片培養中，給予PHA-767491能降低神經膠質細胞的增生。在SCA17小鼠的動物模型中，給予PHA-767491亦可改善步態異常和降低了神經炎症情況，根據以上結果，我們認為聚焦在抑制神經炎症的途徑，可能是一種治療SCA17疾病的潛在策略。Item 順鉑導致斑馬魚胚胎離子細胞氧化壓力與細胞凋亡(2020) 吳巧羚; Wu, Ciao-Ling順鉑為現今廣泛使用之化療藥物，卻伴隨腎毒性、神經毒性和耳毒性等副作用，其中主要限制施予劑量的因素為腎毒性。順鉑可經由銅離子運輸蛋白與有機陽離子運輸蛋白進入腎臟上皮細胞，造成腎小管損傷，目前哺乳動物細胞研究模式已知氧化壓力生成是順鉑造成細胞損傷的主要原因之一。斑馬魚是廣泛使用於毒理學研究與藥物測試的模式動物，其仔魚表皮分布的五型離子細胞與哺乳動物腎臟上皮細胞有許多相似之處，因直接暴露於環境，好操作且易觀察。本研究以斑馬魚仔魚表皮離子細胞作為研究順鉑腎毒性之工具，使用活體螢光染色觀察順鉑對離子細胞的影響，來證實順鉑會導致離子細胞氧化壓力生成、粒線體損傷和細胞凋亡。本實驗將斑馬魚胚胎浸泡於不同濃度的順鉑（0、50、100、300、500 或 1000 μM）進行長時間（4-100 hpf）或短時間（96-98 hpf）處理，再使用活體螢光染劑單染或共染的方式，標定斑馬魚仔魚卵黃囊上具粒線體活性離子細胞（Rhodamine 123/MitoTracker）與凋亡細胞（AcridineOrange），並探討當中活性氧化物的產生（CellROX/ MitoSOX）。斑馬魚胚胎分別在順鉑處理 96小時及 2 小時後，Rhodamine 123 標定具粒線體活性離子細胞數目均顯著下降，且凋亡細胞數目顯著上升；斑馬魚胚胎分別在順鉑處理 96 小時及 1 小時後，產生活性氧化物的離子細胞數目或 CellROX/MitoSOX 的螢光亮度均顯著上升。此外，將斑馬魚胚胎進行抗氧化劑 NAC（0、100、300、500 或 1000 μM）與順鉑的長時間共處理，發現 NAC 能降低胚胎的死亡率，並減緩順鉑對離子細胞所導致的氧化壓力與損害。由以上結果可證實順鉑會導致離子細胞氧化壓力生成和粒線體損傷，並引起細胞凋亡，而抗氧化劑 NAC 可作為順鉑毒性的保護劑。Item 以癌細胞株與動物模式探討吲哚結構化合物對於腫瘤細胞的生長抑制及其機轉(2011) 黃信銘; Sin-Ming Huang背景：前人研究指出，多種吲哚類化合物具有抑制細胞分裂的效果，進而導致癌細胞的細胞週期停滯和細胞凋亡。我們實驗室先前的研究證明，3-indole這個新穎的吲哚結構化合物可在30M的濃度下，藉由粒線體途徑（mitochondrial pathway）引起肺癌細胞凋亡，並在動物模式中抑制腫瘤生長。目的：本篇研究探討低濃度3-indole（10M）對癌細胞造成的生長抑制及其分子機轉。另外，我們也發展了另一個新穎的吲哚類化合物—SK228。我們利用細胞及動物模式，探討其對癌細胞生長的影響及其分子機轉。結果：在以10M 3-indole處理A549、CL1-1及H1437肺癌細胞株之後，發現癌細胞生長被抑制，並且造成細胞週期停滯於G1期。3-indole引起的DNA損傷由Comet assay所驗證，並且數種DNA損傷反應蛋白質及G1期調控蛋白質（例如RB、p53、p21和 SMAD3）在3-indole處理後表現量增加。我們進一步發現，3-indole也會引起DNA損傷反應路徑—ATM/ATR路徑的活化；另外，活性氧自由基（reactive oxygen species, ROS）的抑制劑rotenone能降低3-indole引起的DNA損傷和ATM/ATR反應路徑的活化。這些結果指出，ROS在3-indole引起的癌細胞生長抑制中，扮演重要的角色；動物異種移植（xenograft）實驗進一步證明，3-indole在細胞模式中活化的反應路徑，亦可見於動物模式中。在SK228的研究中，我們發現該化合物可有效的抑制肺癌及食道癌細胞生長，而對於正常肺纖維母細胞則無明顯影響。在以SK228處理過的細胞中，觀察到代表細胞凋亡的「細胞膜內膜外翻」的現象，指出SK228會引起細胞凋亡。我們進一步驗證了，SK228藉由與DNA的結合、鑲嵌及產生ROS而造成DNA的結構改變及損傷。SK228的處理會促進cytochrome c從粒線體釋放至細胞質中，以及caspase-3 和 caspase-9的活化，但不影響caspase-8的活性，並且這些反應可被ROS的抑制劑rotenone所抑制。另外，BCL-2家族的蛋白質表現量及粒線體外膜的完整性，亦受到SK228的影響。我們更進一步發現，SK228藉由降低FAK/paxillin路徑及RhoA的活性而抑制癌細胞的轉移能力。另外，動物實驗也證明SK228可有效抑制腫瘤細胞的生長，並且沒有引起明顯的體重變化或血液學、生化學上的明顯傷害。而且，藉由TUNEL assay和免疫組織化學染色證明，SK228可在動物模式中誘發癌細胞的細胞凋亡，進而抑制腫瘤生長。結論：本實驗證明，低濃度3-indole會藉由產生ROS而造成DNA損傷，並引起ATM/ATR路徑和TGF-β/SMAD路徑的活化，進而使細胞產生細胞週期G1期停滯現象。另外，SK228會藉由造成DNA損傷及ROS的產生而誘使癌細胞經由粒線體路徑進行細胞凋亡，並且也證明SK228可以在低濃度下有效抑制癌細胞的轉移能力。Item 營養缺乏對神經瘤母細胞轉殖入PPP2R2B的影響(2011) 李蕙芳; Hui Fang Li蛋白磷酸酶2A (PP2A) 是絲胺酸/酥胺酸去磷酸酶，由催化次單元、骨架次單元與調控次單元所組成的三體蛋白。其中PPP2R2B (Bβ)是特別作用在腦部的調控單元，會經由選擇性剪接後，生成兩種蛋白異構物：Bβ1與Bβ2。前者表現於細胞質中，後者表現於粒線體。過去研究顯示，異常表現PP2A的細胞與神經退化疾病的發生有關。過去本實驗室以SK-N-SH轉殖入Bβ1基因與Bβ2基因建立穩定細胞株。實驗顯示Bβ1與Bβ2是藉由細胞自噬(autophagy)方式維持細胞生存。過去的研究中發現，這類轉殖的穩定細胞會受外來氧化壓力的影響，並在細胞自噬相關基因失活時提高其細胞存活。 過去的研究中顯示，細胞株在飢餓壓力下，會以細胞凋亡維持細胞存活。本計畫以HBSS (Hank’s Balanced Salts Solution) 作為細胞飢餓壓力的來源。研究結果顯示轉殖Bβ1的SK-N-SH細胞在HBSS環境會促使細胞自噬。並試以細胞自噬抑制劑20μM 3-MA處理，發現3-MA可抑制因飢餓壓力所造成的細胞自噬，進而減少後續的細胞凋亡，而使細胞的存活提高，但是抑制lysosome及autophagosome的抑制劑Bafilomycin A1，則沒有減少後續細胞凋亡的效果。此外，添加胺基酸glutamine可以減少的細胞自噬，進而降低細胞凋亡，但非必需胺基酸(NEAA)則無此效果。 此項研究可對於研究神經細胞異常表現PPP2R2B後，在不同環境壓力下，提供更好的研究模式及瞭解細胞自噬生成機制。Item raw透過限制Dpp的表現抑制果蠅心臟細胞的死亡(2009) 楊勝安; Sheng-An YangRaw是djnk作用途徑的組成分子之一，且在背部癒合時能夠調控dpp在leading edge的表現。raw突變的果蠅胚胎中，Dpp的表現範圍於胚胎發育中期(第12-14時期)時將會顯著擴張。以往的研究證實在中胚層表現過多的dpp會造成心臟先驅細胞的增生，而raw突變的果蠅在第13-14時期時，心臟先驅細胞也會過度表現，且心臟細胞的增生與過度表現的dpp於時空上是一致的。然而到了胚胎發育的晚期，多種類型的心臟細胞表現卻都消失。因為在raw突變的果蠅胚胎中，在背部的外胚層和中胚層都有大量的細胞死亡，因此我們假設心臟細胞的缺失是由細胞凋亡所引起。另一方面，因為死亡的細胞和過度表現的dpp於時空上也有高度的一致性，表示過量的dpp可能是造成果蠅細胞凋亡的原因。在本研究中，我們也證實單獨表現dpp即可造成細胞凋亡，且細胞死亡的程度與dpp的活性成正比。此外我們也在中胚層表現顯性抑制的dTAK1而減少了raw突變中的心臟細胞凋亡，證實dpp是透過dTAK1而造成細胞的死亡。另一方面dTAK1也被證實能夠活化dpp及djnk的表現，這代表中胚層的djnk訊號將會持續的被來自背部外胚層大量表現的dpp所活化。再者，我們也證實表現顯性抑制的p53可以減少因為在中胚層大量表現dTAK1所造成的細胞凋亡。因為在哺乳動物中，BMP訊息路徑所造成的細胞凋亡也由dTAK1所中介，因此由BMP所造成的細胞凋亡於演化上應該是非常保守的。Item 非小細胞肺癌細胞轉殖突變Akt基因對玫瑰樹鹼抗藥性的影響(2008) 陳詩萍; Shih-Ping Chen拓樸異構酶抑制劑ellipticine是具有抗癌效果的化學治療藥劑之ㄧ，但它在肺癌化學治療效應報導不多。本研究發現ellipticine可抑制人類非小細胞肺癌(NSCLC)A549細胞株的生長。但轉殖突變Akt-Ser473質體至細胞後，由ellipticine所誘導產生的細胞凋亡會被抑制。更多證據顯示ellipticine可調節細胞內部生長存活相關因子Akt與p53共同移動至細胞核，而當轉殖突變Akt-Ser473質體後，p53與Akt的核移動則會被抑制。此外，轉殖突變Akt-Thr308質體雖會抑制細胞凋亡的發生，但其效應較Akt-Ser473不明顯。此外，轉殖野生型p53進入p53缺失的H1299細胞株後，也會有類似的效果﹔但是若轉殖突變p53，則不會有這種效果。因此，可以看出ellipticine可促進細胞p53與Akt移動至細胞核及Akt於Ser-473位點的磷酸化，得以調控ellipticine所引發的細胞凋亡。有更多的證據顯示A549細胞株經由ellipticine所引發的細胞凋亡與細胞自噬的形成有關，這點可使用acridine orange染色來證明。當轉殖突變Akt質體後，ellipticine所誘導的細胞自噬體聚集也會降低，此外，使用細胞自噬抑制劑也有相同的效果。因此本研究顯示ellipticine所誘導產生的細胞凋亡是與Akt及p53移動至細胞核及細胞自噬形成有關。Item 鑑定新藥物NCT016以治療阿茲海默症(2015) 游蕍甄; Yu Yu-Chen阿茲海默症（Alzheimer’s disease）是漸進性的神經退化性疾病，其病徵包括漸進性的記憶能力損失以及在大腦皮質和海馬迴等區域有類澱粉斑塊（amyloid plaque）產生。膽鹼性假說（cholinergic hypothesis）說明乙醯膽鹼（acetylcholine）的濃度下降會導致認知與記憶能力的損失。先前的研究顯示，當抑制乙醯膽鹼酯酶（acetylcholinesterase），水解乙醯膽鹼的酵素，可以提升腦部乙醯膽鹼的濃度，而改善AD病人腦中膽鹼神經（cholinergic neuron）之間的訊息傳導。目前用於治療AD的藥物當中乙醯膽鹼酯酶抑制劑仍佔有一席之地，其可改善病徵以及認知功能。所以本篇研究目的在於鑑定黃芩萃取物NCT016是否可以有效抑制乙醯膽鹼酯酶的活性來保護神經細胞的新穎藥物。本實驗使用的細胞模式是Tet-On Aβ42-GFP SH-SY5Y人類神經瘤母細胞，以及動物模式APP/PS1/tau的基因轉殖鼠來進行實驗。得到的初步結果顯示，在細胞模式中NCT016可以降低乙醯膽鹼酯酶的活性；藉由降低β-secretase （β-site APP-cleaving enzyme 1，BACE1）、類澱粉前驅蛋白C端片段蛋白（APP β-C-terminal fragments，β-CTF）和類澱粉蛋白（Aβ42）的表現量以減緩類澱粉蛋白產生途徑（amyloidogenic pathway）；增加粒線體膜電位並降低Bax/Bcl-2 ratio以改善粒線體的功能；降低cleaved caspase-9 和cleaved PARP的表現量避免細胞走向細胞凋亡（apoptosis）；並且增加神經纖維（neurite）的長度和複雜度以改善神經纖維生長（neurite outgrowth）。在動物模式中，NCT016可以改善基因轉殖鼠在空間上的學習與記憶能力以及短期記憶能力；降低其大腦中類澱粉前驅蛋白（APP）、BACE1和p-tau的表現量以及減緩粒線體調控的細胞凋亡路徑。總結來說，NCT016可作為治療阿茲海默症的藥物來抑制乙醯膽鹼酯酶的活性、類澱粉蛋白產生途徑和細胞凋亡路徑，並增加粒線體功能等。