學位論文
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Item 1. 抑制肺癌腫瘤細胞增生的新穎小分子藥物篩選及其反應機制2. 玫瑰樹鹼對肺癌細胞誘導Akt及p53核移動及生長抑制(2012) 游雅竹; Ya Chu Yu1.本論文使用肺癌細胞株為模式，自42個化學合成有機小分子，利用細胞生長速率測試 (MTT assay)，篩選出在低濃度下可以降低細胞生長速率之藥物。其中oxazoline衍生物MZ-01-059能夠有效在5 μM下降低A549細胞的生長速率。次由細胞群落分析證實MZ-01-059可以抑制癌細胞的增生。為了確認非小細胞肺癌的生長率下降是否與細胞凋亡相關，實驗再利用propidium iodide染色後DNA，進行後流式細胞分析，觀察細胞週期變化。實驗結果顯示MZ-01-059會讓具有野生型p53之細胞株A549及H460產生細胞凋亡。其中以H460細胞株較為顯著；但對不具有p53之H1299細胞，則會停滯在S及G2/M週期。另由二維流式細胞儀分析結果，確立H460肺癌細胞主要是以晚期細胞凋亡 (late apoptosis) 方式降低細胞存活率。由西方轉漬法鑑定與細胞凋亡相關的蛋白，發現MZ-01-059處理後細胞，會活化腫瘤抑制基因p53，此外也會使pro-caspase-3以及poly ADP ribose polymerase切割；而LC3-II (microtubule-associated protein 1 light chain 3) 在A549及H1299細胞株會增加，因此推斷這兩種細胞是先以細胞自噬保護細胞，再產生細胞凋亡，證實這個藥物所引發細胞凋亡與細胞自噬相關。本論文結果也顯示MZ-01-059能夠在低濃度下誘導活化在非小細胞肺癌引發不同程度的細胞凋亡，且與p53活化有關。 2.拓樸異構酶II抑制劑玫瑰樹鹼 (ellipticine) 為具有抑制癌細胞生長的抗癌藥物，本實驗室過去研究指出藥物可經由活化p53，使人類非小細胞肺癌A549細胞株凋亡。本論文持續探討細胞生長因子Akt對於p53進入細胞核的影響，研究使用轉殖p53質體至H1299的穩定細胞株 (HW16)。但當加入外源Akt會增加ellipticine對細胞生長的抑制效應，並讓sub G1週期細胞數目上升，而Akt及p53會被共同誘導移入細胞核內，DNA修補酶PARP也受到剪切。但將AktS473位點突變後，誘導產生的細胞凋亡會被抑制；而AktT308位點突變後抑制能力則較不明顯。Ellipticine所引發的細胞凋亡也與細胞自噬的形成有關，加入Akt後細胞內LC3-I轉換成LC3-II的比例增加，但當AktS473位點突變後，所誘導的細胞自噬也會降低。因此本研究顯示ellipticine所誘導產生的細胞凋亡是與Akt及p53移動至細胞核及細胞自噬形成有關，且AktS473位點的磷酸化對於藥物引發的細胞凋亡具有重要性。Item 1. 探討夏枯草抑制非小細胞肺癌細胞轉移機制 2.篩選以細胞自噬去除神經細胞堆積多麩胺酸的小分子新穎化合物(2012) 黃中岳; CHUNG-YUEH HUANG1. 癌症是由於體細胞複製脫離正常的調控而不斷快速複製異常細胞的現象。異常增生的細胞形成腫瘤侵入週邊組織持續擴大並影響原發部位的器官功能及壓迫周遭器官；而癌細胞進入人體的血液循環以及淋巴系統轉移至其它部位增生，更是具有威脅性。 癌細胞的轉移，與分解細胞外基質(extracellular matrix, ECM)，以及促進血管新生的能力有很大的關聯。而在這些過程中，基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)扮演了一個十分重要的角色。 本研究利用中草藥處理人類肺腺癌細胞株(A549、H460及H1299)以及以化學合成藥物處理p53 mutation 之肝癌細胞株(Huh7)。實驗首先利用gelatin zymography assay篩選出具有抑制MMP-9與MMP-2活性能力之藥物，並以western blot觀察細胞懸浮液MMP-9與MMP-2的表現量。接著觀察藥物是否對細胞有毒性，再以wound healing assay觀察癌細胞移動能力的影響；最後以invasion assay觀察中藥對腫瘤細胞的侵入能力的影響。綜合以上的實驗結果看出，夏枯草能夠對肺癌細胞的MMP-9與MMP-2活性產生抑制效果，而且可以抑制肺癌細胞的入侵以及移動能力，在H460細胞株上的效果較為顯著，且藥效不會因p53的狀態而受到影響。另外本次實驗並沒有在所試驗的化學合成藥物中觀察到具抑制MMP活性的合成藥物。 2. 細胞自噬(autophagy)是細胞一個重要的維持細胞生存的方式。細胞透過這個過程，清除細胞中非必要的物質，以取得胺基酸等營養物質，也避免細胞異常的物質累積。自噬過程中，細胞會將目標物質包覆在雙層膜節構中形成自噬體(autophagosome)，再與溶酶體(lysosome)融合，降解目標物質，並且回收營養物質和能源。 Polyglutamine (polyQ) disease是一種在神經性退化症，其主要的病因是在基因中出現CAG或CUG的重複序列的異常增加。目前已經證明藉由調控自噬作用的藥物在polyQ disease，如亨丁頓氏症 (Huntington’s disease)小鼠模型可以減輕其毒性，因此增強自噬作用的藥物，可能會是對這種疾病的治療方式。 本論文轉殖了結合不同長度polyQ的綠色螢光蛋白基因之SK細胞株，將穩定的細胞株用各種合成化學物質複合物進行處理之後，使用螢光染色，觀察自噬體是否增加且觀察對細胞存活的影響。本論文初步篩選出了三種能夠誘導細胞自噬增加並減少polyQ堆積的小分子化合物。未來研究會再繼續確認細胞自噬對清除細胞polyQ堆積的機制。Item 非小細胞肺癌細胞轉殖突變Akt基因對玫瑰樹鹼抗藥性的影響(2008) 陳詩萍; Shih-Ping Chen拓樸異構酶抑制劑ellipticine是具有抗癌效果的化學治療藥劑之ㄧ，但它在肺癌化學治療效應報導不多。本研究發現ellipticine可抑制人類非小細胞肺癌(NSCLC)A549細胞株的生長。但轉殖突變Akt-Ser473質體至細胞後，由ellipticine所誘導產生的細胞凋亡會被抑制。更多證據顯示ellipticine可調節細胞內部生長存活相關因子Akt與p53共同移動至細胞核，而當轉殖突變Akt-Ser473質體後，p53與Akt的核移動則會被抑制。此外，轉殖突變Akt-Thr308質體雖會抑制細胞凋亡的發生，但其效應較Akt-Ser473不明顯。此外，轉殖野生型p53進入p53缺失的H1299細胞株後，也會有類似的效果﹔但是若轉殖突變p53，則不會有這種效果。因此，可以看出ellipticine可促進細胞p53與Akt移動至細胞核及Akt於Ser-473位點的磷酸化，得以調控ellipticine所引發的細胞凋亡。有更多的證據顯示A549細胞株經由ellipticine所引發的細胞凋亡與細胞自噬的形成有關，這點可使用acridine orange染色來證明。當轉殖突變Akt質體後，ellipticine所誘導的細胞自噬體聚集也會降低，此外，使用細胞自噬抑制劑也有相同的效果。因此本研究顯示ellipticine所誘導產生的細胞凋亡是與Akt及p53移動至細胞核及細胞自噬形成有關。Item 單側輸尿管阻塞誘發氧化壓力對大鼠腎小管細胞之凋亡與自噬表現之影響(2008) 賴亭諭; Lai Ting-Yu單側阻塞性尿路疾病是指尿液無法經由腎臟或輸尿管流入膀胱，尿液迴流造成腎水腫。其發生原因如單側輸尿管結石、狹窄、腫瘤、受傷等，但仍以腎結石最常見，而單側輸尿管阻塞則是一種適合模擬阻塞性尿路腎臟漸進式纖維化發展過程的病理模型。本研究主要在探討單側輸尿管阻塞造成腎臟損傷過中，活性氧、細胞凋亡與細胞自噬的角色以及細胞凋亡與細胞自噬的關係。本實驗利用大白屬於其右側輸尿管靠近腎臟三分之ㄧ處用兩條繩子分別打結，接著縫合腹腔。之後將老鼠隨機分成八組，第一組無進行結紮手術，其餘分別於術後4hr、8hr、12hr、1天、3天、5天、7天進行生理實驗並抽取500μl腎靜脈血進行自由基測定，另外動物犧牲後取阻塞腎臟，利用西方墨點法測定蛋白表現量；使用免疫組織染色觀察腎臟組織型態。結果發現腎靜脈血液H2O2/OH.-類的自由基於阻塞後四至十二小時期間有上升趨勢，而Catalase和MnSOD的蛋白表現從阻塞四小時開始就隨時間下降；腎臟組織Bax/Bcl-2比值及Caspase 3蛋白表現表現則增加；自噬作用的起始蛋白Beclin1及中期蛋白Atg5-Atg12和後期蛋白LC3表現則在阻塞3天後開始逐漸增加，從切片染色結果也發現自噬作用發生在腎臟近端與遠端腎小管處。我們的結果發現自噬作用蛋白和凋亡作用蛋白表現時間一致，表示自噬作用在單側輸尿管阻塞動物模式中有協同細胞死亡的功能。