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End date: 2019Subject: search.filters.subject.氧化壓力

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    一條根萃取物活性成分改善環磷醯胺誘導膀胱功能障礙與病理機制之大鼠模式
    (2019) 吳宮頡; Wu, Kung-Chieh
    一條根（I-Tiao-Gung）在金門當地已經普遍被廣泛使用於治療風濕性疾病以及痠痛之傳統中草藥。而金門一條根屬於豆科植物的闊葉大豆（Glycine tomentella Hayata），且豐含天然植物雌激素黃酮類及酚類物質，有研究指出一條根具有抗發炎及抗氧化能力之功效。 膀胱過動症（OAB）是一種很常見且又很容易被忽略的疾病。膀胱過動症的起因是由多重因素所造成的，如尿道出口阻塞、細菌感染及尿路上皮受損等症狀，在病生理學上，當膀胱過動症確診後，會引起尿道損傷及慢性發炎的症狀。環磷醯胺（Cyclophosphamide, CYP）是一種化療藥物，具有高毒活性代謝物，在尿液中對膀胱產生急性或慢性之損傷，包含出血性膀胱炎。我們使用環磷醯胺腹腔注射誘導膀胱過動症的大鼠模式，當膀胱發炎時機械敏感性的傳入神經變得較敏感，將導致膀胱過動（Bladder hyperactivity）。膀胱發炎會引起活性氧（ROS）的產生，而活性氧是氧化壓力形成的原因之一，且其最終可能會導致膀胱功能障礙。 因此，我們探究內服給予中藥一條根萃取物中黃豆戒（Daidzin）活性成分對環磷醯胺誘導膀胱炎、氧化壓力、纖維化和發炎及膀胱過動症之治療潛力。本研究使用Wistar 大鼠，其CYP給予方式為腹腔注射，一條根及黃豆戒為口服管餵方式。我們透過西方墨點法檢測，蕈鹼受體M2和M3和P2X2和P2X3嘌呤能受體以及3-硝基酪氨酸（3-NT）和NADPH氧化酶4（NOX4）的表現，以及動物膀胱內壓與尿道外括約肌電圖相關之檢測。此外，我們透過超靈敏化學發光分析儀，從而確定了膀胱活性氧（ROS）的量，以及透過細胞因子陣列來確認多種細胞因子譜的表現包含在內的MMP-8和TIMP-1。我們結果顯示，一條根萃取中黃豆戒活性成可有效改善環磷醯胺誘導膀胱炎和恢復第二階段的活性作用（EUS-EMG），並抑制P2X2，P2X3，M3受體，3-NT，NOX4的表達。結論，一條根萃取成分和其主要活性成分黃豆戒可降低環磷醯胺誘導氧化壓力且可抑制環磷醯胺造成之MMP-8、TIMP-1、發炎和纖維化。
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    新型AMPK活化劑Nstpbp168對於胰島分泌細胞的保護作用
    (2013) 邱富嶼; Fu-Yu Chiu
    Nstpbp168是由植物分離出來的純化合物，在我們先前的研究發現它是一種新穎的AMPK活化劑。而本次研究目主要是探討Nstpbp168在氧化壓力及脂質毒性下對胰島素分泌細胞的活存率與活性氧化物產生是否是有正面影響。在氧化壓力的刺激下，胰島素分泌細胞RINm5F曝露於含有40 μM過氧化氫溶液，而後投予100 μM Nstpbp168培養十八小時，計數細胞的存活率與活性氧化物生成量。此外，在脂質毒性刺激方面，則是將RINm5F及肝臟細胞HepG2培養於含有100 μM Nstpbp168 及palmitate/BSA混合物的培養液，進而以MTT檢測其細胞存活率及DCFH-DA染劑觀察細胞內超氧物質含量的螢光圖像。研究的結果顯示，Nstpbp168可以在過氧化氫誘導之氧化壓力下呈現劑量依存的方式防止細胞死亡。此外，在NBT檢測的結果發現細胞經由Nstpbp168處理後能有效抑制過氧化氫所誘導出活性氧化物，並證明Nstpbp168對於AMPK的活化呈現劑量依存的關係。AMPK的拮抗劑Compound C可明顯阻止Nstpbp168的保護作用在過氧化氫對於胰島素分泌細胞產生的傷害。此外，Nstpbp168具有防止palmitae引起之細胞死亡，推論是藉由促進AMPK活化以減少活性氧的產生。綜以上所述，Nstpbp168對於細胞具有保護作用，可有效防止氧化性壓力及脂質累積之毒性所造成的傷害，而這些保護的功能可能均是藉由促進AMPK活化的機制所達成。
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    Nrf2與神經退化性疾病：啟動子多型性與 以氧化壓力為目標的治療策略
    (2012) 巫逸琦; Yi-Ci Wu
    Nuclear factor-erythroid 2 (NF-E2)-related factor 2 (Nrf2)是basic leucine zipper (bZIP)的轉錄因子，可調節抗氧化路徑基因的活化，並維持細胞內氧化還原的平衡。氧化壓力的增加與許多神經性退化性疾病有相關性。舉例來說，帕金森氏症(PD)的致病機制就會受到氧化壓力的影響，增強Nrf2的活化會對於神經細胞有保護性的功效。在polyQ不正常擴增的脊髓小腦萎縮症中，擴增的CAG三核苷酸轉譯出的polyQ蛋白，聚集在細胞內增加細胞內的氧化壓力。本論文先以PCR-RFLP技術，對Nrf2基因啟動子-653 A/G、-651 G/A和-617 C/A多型性，進行帕金森氏症患者(n = 480)與年齡、性別配合的正常人(n = 526)的病例-對照組研究。結果多型性基因型、等位基因頻率、單套型等均並未發現相關性。另外，本研究建立誘導式ATXN3/Q14~75的Flp-In SH-SY5Y細胞株，添加retinoic acid誘導分化後，表現具有病理特徵的ATXN3/Q75融合蛋白會形成聚集，並伴隨神經纖維生長減緩。藉高通量影像分析及免疫轉漬分析，此細胞株處理中草藥NH004、NH008、NH021及NH008某組成份衍生物NH008-1可活化Nrf2的表現，並降低ATXN3/Q75融合蛋白的聚集，故可能發展為有潛能的治療策略。
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    以SCA3誘導細胞模式進行潛力新藥之篩選
    (2011) 陳星蓉; Hsing-Jung Chen
    小腦脊髓運動失調症第三型(spinocerebellar ataxia type 3; SCA3)，亦稱Machado–Joseph disease (MJD)，為小腦脊髓運動失調症眾多亞型中最常見的一型，屬於晚發性自體顯性遺傳的神經退化性疾病。主要是因為座落於14q24.3-q32的MJD1基因發生CAG三核苷酸過度擴增的現象，這些擴增的CAG序列會轉譯出含多麩醯胺酸(polyglutamine; polyQ)序列的蛋白質產物ataxin3 (AT3)，突變的AT3會在細胞內聚集，透過蛋白質水解機制切割後，在細胞核內形成包含體(nuclear inclusions; NIs)產生細胞毒性使得細胞死亡。目前SCA3實際的致病機轉尚未明瞭，為了解AT3與SCA3病程中的致病機制，我們建立AT3誘導表現的PC12細胞模式。我們發現75Q細胞在氧化壓力以及蛋白質酶抑制劑處理過後會比27Q細胞更容易產生蛋白質聚集在細胞核以及細胞和周圍的現象，對於壓力藥物的耐受性也比27Q細胞要低許多。因此我們藉由建立的SCA3細胞模式做一系列新穎組蛋白去乙醯酶抑制劑(histone deacetylase inhibitors; HDACi)藥物篩選，結果發現某些抑制劑藥物確實能保護SCA3細胞，提升細胞存活率以及神經細胞分支生長，降低氧化壓力以及蛋白質聚集的現象，並增加組蛋白(histone)乙醯化及活化許多具神經保護性的訊息傳遞路徑例如Hsp27、ERK、 MnSOD 和NF-κB等。因此，組蛋白去乙醯酶抑制劑藥物或許可成為治療SCA3的良好候選療法。
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    第十七型脊髓小腦共濟失調症(SCA17)細胞模式的新穎化合物篩檢及氧化壓力研究
    (2011) 黃詩涵; Shih-Han Huang
    第十七型脊髓小腦運動失調症(spinocerebellar ataxias 17，簡稱SCA17)是起因於TATA-box binding protein (TBP)基因上的CAG三核苷重複序列重複擴增，導致轉譯出異常的polyQ蛋白。在正常人族群中polyQ蛋白重複的數目約25到42之間，而SCA17疾病的患者polyQ蛋白重複數目擴增至43到66之間。polyQ蛋白擴增會造成多胜肽的構型改變，促使蛋白質錯誤摺疊和聚集(aggregation)，並進ㄧ步形成不溶性的蛋白包涵體(inclusion)。隨著對疾病致病機轉的瞭解增加，也使疾病治療的發展有很大的進展。本論文即建立表現EGFP標記、polyQ擴增的TBP N端蛋白的293細胞，處理合成的indole、quinoxaline化合物(由化學系姚清發和陳焜銘老師所提供)，藉計算包含聚集物的細胞的比例，及不溶性TBP-EGFP融合蛋白定量，來檢測化合物對抑制polyQ蛋白聚集的效果。結果顯示338化合物降低融合蛋白聚集的程度比SAHA略好(64.3% vs. 66.1%；70.7% vs. 77.4%)。而且338的IC50 (396 μM)遠高於SAHA (31.4 μM)，可能作為未來發展治療SCA17疾病的參考藥物。此外，由於擴增的polyQ蛋白會造成氧化壓力，增加粒線體功能損傷，本研究亦利用年齡與性別配對的淋巴細胞株，來檢測氧化壓力在SCA17疾病上扮演的角色，結果發現SCA17病人細胞較正常人細胞對氧化壓力的耐受性差。 關鍵字：第十七型脊髓小腦運動失調症、polyQ蛋白、氧化壓力
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    PPP2R2B 基因外遺傳研究及細胞模式研究
    (2010) 高慈蓬
    PP2A為真核細胞內一種普遍的絲胺酸/酥胺酸去磷酸酶。PP2A全酶包含結構骨架A次單位、調節B次單位、催化C次單位。PPP2R2B (Bβ)為普遍表現在大腦組織中的調控次單位。PPP2R2B基因透過基因啟動子的差異使用及選擇性裁接，產生Bβ1和Bβ2兩種異構型蛋白。Bβ1啟動子上CAG三核苷酸重複擴增，可能因導致細胞質中Bβ1表現量的上升，而與第十二型脊髓小腦萎縮症相關。相反的，病例-對照組及啟動子的研究顯示，罕見短的CAG三核苷酸重複等位基因和低轉錄活性及阿茲海默氏症相關。為探討Bβ1在阿茲海默氏症上可能扮演的角色，本研究透過bisulfite處理及選殖定序，檢查5個阿茲海默氏症患者及年齡與性別配對的正常人，Bβ1啟動子1 kb片段的序列甲基化情形，結果發現患者的甲基化程度略高於正常人(雖然差異未達顯著性)，顯示外遺傳改變可能影響阿茲海默氏症患者Bβ1的表現。此外，本研究並用穩定誘導表現Myc標籤的Bβ1及Bβ2細胞株，來探討Bβ調節的PP2A在神經退化中的角色。結果發現表現Bβ2的細胞活性氧自由基增加。氧化劑TBH及Aβ1-40的添加更顯著提昇Bβ2表現細胞的活性氧自由基。
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    以果蠅為模式分析PP2A Bb調控次單元在粒線體重塑及細胞凋亡的功能
    (2010) 王俞鈞; Yu-Chun Wang
    　　第十二型脊髓小腦萎縮症致病原因歸因於ppp2r2b表現量的提高，為了探討釐清此退化性神經失調以及尋找藥理學的治療藥物，因此本研究建立一SCA12的果蠅動物模式藉由大量表現ppp2r2b在果蠅的同源基因,tws。藉由異位表現tws會導致許多病理特徵，包括神經退化、細胞凋亡以及縮短壽命。而更進一步的研究發現提高ppp2r2b或tws的表現會促使粒線體斷裂並伴隨著增加細胞中的氧化壓力(ROS)及細胞色素c(Cyt c)以及增加半胱氨酸蛋白酶3(caspase 3)的活性。藉由穿透式電子顯微鏡(TEM)的結果顯示在過度表現tws的果蠅感光神經細胞中發現斷裂的粒線體會伴隨著塉(cristae)的破壞並會被細胞自噬體(autophagosome)所吞沒。除此之外，轉殖果蠅對於巴拉刈所引起的氧化壓力更為敏感。相比之下，異位表現dSOD2及藉由餵食抗氧化劑可有效的降低氧化壓力(ROS)及半胱氨酸蛋白脢3(caspase 3)的活性，並延長SCA12果蠅模式的生存壽命。總而言之，我們的研究顯示粒線體的功能失調所引發的氧化壓力是造成SCA12的原因，以及降低氧化壓力為神經病理學更提供一可能的治療性方法。我們的結果也顯示Tws也參與在發育性的程式細胞死亡機制中。現在我們正在仔細研究Tws在細胞凋亡路徑上所扮演的上位性。除此之外，也正在探究中的是Tws可能參與調控的下游目標蛋白例如粒線體重塑蛋白PINK1以及Drp1。
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    熱休克蛋白過度表現及氧化壓力對SCA17細胞模式影響之研究
    (2009) 王品蓉; Pin-Rong Wang
    脊髓小腦運動失調症(spinocerebellar ataxias，簡稱SCAs)為體染色體顯性遺傳的神經退化性疾病，有超過28種的亞型。其中的遺傳性第十七型脊髓小腦運動失調症(SCA17)與染色體6q27位置TATA binding protein (TBP)基因的CAG三核苷重複擴增相關。突變的TBP蛋白具有延長的聚麩醯胺(polyQ)片段，可能導致蛋白質結構錯誤摺疊及聚集，而polyQ擴增造成的氧化壓力與疾病形成有關。當細胞處於氧化壓力下，會提升熱休克蛋白的表現，如HSPA5、HSPA8和HSPB1等監護蛋白(chaperones)，以便抵抗氧化壓力所造成的傷害。監護蛋白可經由穩定錯誤摺疊蛋白的結構，降低聚集的生成，來緩和polyQ突變蛋白的毒性。藉由熱休克蛋白和氧化壓力與SCA17的關連性做探討，我們可以更瞭解SCA17的致病機轉，有助於疾病的改善或治療策略的發展。藉誘導式細胞模式的建立，本篇研究結果顯示擴增polyQ的TBP蛋白聚集在細胞核中，且細胞週期呈現較高的sub G1%。表現擴增polyQ的TBP使細胞活性氧分子產量增加，且對staurosporine處理的敏感度提升及缺血清的耐受度下降。短暫表現TBP的細胞模式顯示，HSPA5、HSPA8和HSPB1的過度表現可以降低聚集的生成。
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    第十七型脊髓小腦運動失調症：遺傳檢測暨細胞模式之氧化壓力與細胞毒性研究
    (2008) 林佩瑛; Pei-Ying Lin
    第十七型脊髓小腦運動失調症（SCA17）為體染色體顯性遺傳的神經退化性疾病，起因於位在染色體 6q27 位置上的 TATA-binding protein（TBP）基因之 CAG/CAA 三核苷酸重複擴增，轉譯出帶有不正常的聚麩醯胺鏈（polyQ tract）的蛋白質產物，造成蛋白質構形改變而產生錯誤摺疊與聚集，導致疾病。目前SCA17致病機轉尚未完全瞭解，且尚無有效治療方法，加上疾病進程發展及變異極大，因此瞭解 TBP 基因 CAG 三核苷酸重複在族群中的分佈情形及探討可能致病機轉，將對發展疾病治療策略有所助益。本論文即以 SCA17 為主題，首先進行臺灣地區正常人族群、帕金森氏症患者族群、原發性顫抖症患者族群與其它神經退化性疾病患者族群的 TBP 基因CAG 三核苷酸重複遺傳分析，發現 CAG/CAA 重複次數的頻率主要集中在 36 個重複序列，並於 OPMD 及 TICS 疾病中發現有兩名不正常擴增的例子（44 and 45 repeats），顯示 TBP 基因重複擴增序列可能與其它神經疾病相關。另一部分利用年齡與性別配對的 SCA17 淋巴細胞株及建立誘導式 SCA17 細胞模式，檢視氧化壓力與熱休克蛋白在 SCA17 上扮演的角色。氧化劑 TBH 處理後兩種細胞模式皆顯示帶有 polyQ 擴增的細胞對氧化壓力的耐受性顯著差於帶有正常 TBP 的細胞，推論氧化壓力可能參與 SCA17 致病機轉。此外，在 SCA17 淋巴細胞株或誘導式 SCA17 細胞模式觀察到 HSPA8 與 HSPB1 表現量的改變，暗示此兩種熱休克蛋白亦可能參與 SCA17 致病機轉。最後，組蛋白去乙醯酶抑制劑 valproate 可增加帶有 polyQ 擴增細胞的存活率的發現，將有利於找出 SCA17 治療策略的目標。
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    環境壓力對人類神經細胞過度表現Protein Phosphatase 2A次單位PPP2R2B的影響
    (2009) 鄭琬婷; Cheng Wan-Ting
    Protein phosphatase 2A (PP2A)是屬於serine/threonine去磷酸酶的一種，能調控細胞的生長、存活和凋亡。哺乳類動物中，Bβ次單位是PP2A在腦神經細胞中的專一表現的次表型。當Bβ基因有所損害或過度表現時，會造成神經細胞的病變。本論文分別將能專一表現於細胞質的Bβ1和專一表現於粒線體的Bβ2質體轉殖入神經腫瘤母細胞SK-N-SH中，建立穩定細胞株。利用H2O2和tert-butyl hydroperoxide (tBHP)作為氧化壓力來源，經48小時的處理後，Bβ2細胞株的存活率會急遽下降，由Annexin V和PI雙重染色的結果中證實是因細胞凋亡而降低存活率，但Bβ1細胞株則否。進一步轉殖LC3-EGFP質體和對酸性液泡胞器染色鑑定細胞自噬的發生，可以看出Bβ2細胞株本身便有些微細胞自噬體存在，當經氧化壓力後更引發Bβ2細胞株有更多細胞自噬體出現。但以細胞自噬抑制劑3-methyladenine (3-MA)對細胞作前處理24小時後，再經過氧化物處理，則各Bβ2細胞株的sub-G1期細胞比例皆會下降，而酸性液泡胞器的密度也明顯降低。證明氧化壓力所引起的細胞凋亡是經由細胞自噬路徑而產生。另利用降低培養液中的血清濃度模擬營養缺乏的情況，當無血清培養48小時的Bβ1細胞株之sub-G1期細胞比例較Bβ2細胞株高出許多，當血清濃度降低時，Bβ1細胞株的酸性液泡胞器也較Bβ2細胞株的密度高，證實營養缺乏在Bβ1細胞株所引發的細胞凋亡是經由細胞自噬。本論文針對過度表現PPP2R2B的細胞株分別於氧化壓力和營養缺乏的壓力下，細胞所產生的生理變化，模擬神經退化病變的產生，並瞭解病變機制，祈能對神經退化疾病的研究與治療有所助益。