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Item Nrf2與神經退化性疾病：啟動子多型性與 以氧化壓力為目標的治療策略(2012) 巫逸琦; Yi-Ci WuNuclear factor-erythroid 2 (NF-E2)-related factor 2 (Nrf2)是basic leucine zipper (bZIP)的轉錄因子，可調節抗氧化路徑基因的活化，並維持細胞內氧化還原的平衡。氧化壓力的增加與許多神經性退化性疾病有相關性。舉例來說，帕金森氏症(PD)的致病機制就會受到氧化壓力的影響，增強Nrf2的活化會對於神經細胞有保護性的功效。在polyQ不正常擴增的脊髓小腦萎縮症中，擴增的CAG三核苷酸轉譯出的polyQ蛋白，聚集在細胞內增加細胞內的氧化壓力。本論文先以PCR-RFLP技術，對Nrf2基因啟動子-653 A/G、-651 G/A和-617 C/A多型性，進行帕金森氏症患者(n = 480)與年齡、性別配合的正常人(n = 526)的病例-對照組研究。結果多型性基因型、等位基因頻率、單套型等均並未發現相關性。另外，本研究建立誘導式ATXN3/Q14~75的Flp-In SH-SY5Y細胞株，添加retinoic acid誘導分化後，表現具有病理特徵的ATXN3/Q75融合蛋白會形成聚集，並伴隨神經纖維生長減緩。藉高通量影像分析及免疫轉漬分析，此細胞株處理中草藥NH004、NH008、NH021及NH008某組成份衍生物NH008-1可活化Nrf2的表現，並降低ATXN3/Q75融合蛋白的聚集，故可能發展為有潛能的治療策略。Item 以SCA3誘導細胞模式進行潛力新藥之篩選(2011) 陳星蓉; Hsing-Jung Chen小腦脊髓運動失調症第三型(spinocerebellar ataxia type 3; SCA3)，亦稱Machado–Joseph disease (MJD)，為小腦脊髓運動失調症眾多亞型中最常見的一型，屬於晚發性自體顯性遺傳的神經退化性疾病。主要是因為座落於14q24.3-q32的MJD1基因發生CAG三核苷酸過度擴增的現象，這些擴增的CAG序列會轉譯出含多麩醯胺酸(polyglutamine; polyQ)序列的蛋白質產物ataxin3 (AT3)，突變的AT3會在細胞內聚集，透過蛋白質水解機制切割後，在細胞核內形成包含體(nuclear inclusions; NIs)產生細胞毒性使得細胞死亡。目前SCA3實際的致病機轉尚未明瞭，為了解AT3與SCA3病程中的致病機制，我們建立AT3誘導表現的PC12細胞模式。我們發現75Q細胞在氧化壓力以及蛋白質酶抑制劑處理過後會比27Q細胞更容易產生蛋白質聚集在細胞核以及細胞和周圍的現象，對於壓力藥物的耐受性也比27Q細胞要低許多。因此我們藉由建立的SCA3細胞模式做一系列新穎組蛋白去乙醯酶抑制劑(histone deacetylase inhibitors; HDACi)藥物篩選，結果發現某些抑制劑藥物確實能保護SCA3細胞，提升細胞存活率以及神經細胞分支生長，降低氧化壓力以及蛋白質聚集的現象，並增加組蛋白(histone)乙醯化及活化許多具神經保護性的訊息傳遞路徑例如Hsp27、ERK、 MnSOD 和NF-κB等。因此，組蛋白去乙醯酶抑制劑藥物或許可成為治療SCA3的良好候選療法。Item 第十七型脊髓小腦共濟失調症(SCA17)細胞模式的新穎化合物篩檢及氧化壓力研究(2011) 黃詩涵; Shih-Han Huang第十七型脊髓小腦運動失調症(spinocerebellar ataxias 17，簡稱SCA17)是起因於TATA-box binding protein (TBP)基因上的CAG三核苷重複序列重複擴增，導致轉譯出異常的polyQ蛋白。在正常人族群中polyQ蛋白重複的數目約25到42之間，而SCA17疾病的患者polyQ蛋白重複數目擴增至43到66之間。polyQ蛋白擴增會造成多胜肽的構型改變，促使蛋白質錯誤摺疊和聚集(aggregation)，並進ㄧ步形成不溶性的蛋白包涵體(inclusion)。隨著對疾病致病機轉的瞭解增加，也使疾病治療的發展有很大的進展。本論文即建立表現EGFP標記、polyQ擴增的TBP N端蛋白的293細胞，處理合成的indole、quinoxaline化合物(由化學系姚清發和陳焜銘老師所提供)，藉計算包含聚集物的細胞的比例，及不溶性TBP-EGFP融合蛋白定量，來檢測化合物對抑制polyQ蛋白聚集的效果。結果顯示338化合物降低融合蛋白聚集的程度比SAHA略好(64.3% vs. 66.1%；70.7% vs. 77.4%)。而且338的IC50 (396 μM)遠高於SAHA (31.4 μM)，可能作為未來發展治療SCA17疾病的參考藥物。此外，由於擴增的polyQ蛋白會造成氧化壓力，增加粒線體功能損傷，本研究亦利用年齡與性別配對的淋巴細胞株，來檢測氧化壓力在SCA17疾病上扮演的角色，結果發現SCA17病人細胞較正常人細胞對氧化壓力的耐受性差。 關鍵字：第十七型脊髓小腦運動失調症、polyQ蛋白、氧化壓力Item PPP2R2B 基因外遺傳研究及細胞模式研究(2010) 高慈蓬PP2A為真核細胞內一種普遍的絲胺酸/酥胺酸去磷酸酶。PP2A全酶包含結構骨架A次單位、調節B次單位、催化C次單位。PPP2R2B (Bβ)為普遍表現在大腦組織中的調控次單位。PPP2R2B基因透過基因啟動子的差異使用及選擇性裁接，產生Bβ1和Bβ2兩種異構型蛋白。Bβ1啟動子上CAG三核苷酸重複擴增，可能因導致細胞質中Bβ1表現量的上升，而與第十二型脊髓小腦萎縮症相關。相反的，病例-對照組及啟動子的研究顯示，罕見短的CAG三核苷酸重複等位基因和低轉錄活性及阿茲海默氏症相關。為探討Bβ1在阿茲海默氏症上可能扮演的角色，本研究透過bisulfite處理及選殖定序，檢查5個阿茲海默氏症患者及年齡與性別配對的正常人，Bβ1啟動子1 kb片段的序列甲基化情形，結果發現患者的甲基化程度略高於正常人(雖然差異未達顯著性)，顯示外遺傳改變可能影響阿茲海默氏症患者Bβ1的表現。此外，本研究並用穩定誘導表現Myc標籤的Bβ1及Bβ2細胞株，來探討Bβ調節的PP2A在神經退化中的角色。結果發現表現Bβ2的細胞活性氧自由基增加。氧化劑TBH及Aβ1-40的添加更顯著提昇Bβ2表現細胞的活性氧自由基。Item 以果蠅為模式分析PP2A Bb調控次單元在粒線體重塑及細胞凋亡的功能(2010) 王俞鈞; Yu-Chun Wang第十二型脊髓小腦萎縮症致病原因歸因於ppp2r2b表現量的提高，為了探討釐清此退化性神經失調以及尋找藥理學的治療藥物，因此本研究建立一SCA12的果蠅動物模式藉由大量表現ppp2r2b在果蠅的同源基因,tws。藉由異位表現tws會導致許多病理特徵，包括神經退化、細胞凋亡以及縮短壽命。而更進一步的研究發現提高ppp2r2b或tws的表現會促使粒線體斷裂並伴隨著增加細胞中的氧化壓力(ROS)及細胞色素c(Cyt c)以及增加半胱氨酸蛋白酶3(caspase 3)的活性。藉由穿透式電子顯微鏡(TEM)的結果顯示在過度表現tws的果蠅感光神經細胞中發現斷裂的粒線體會伴隨著塉(cristae)的破壞並會被細胞自噬體(autophagosome)所吞沒。除此之外，轉殖果蠅對於巴拉刈所引起的氧化壓力更為敏感。相比之下，異位表現dSOD2及藉由餵食抗氧化劑可有效的降低氧化壓力(ROS)及半胱氨酸蛋白脢3(caspase 3)的活性，並延長SCA12果蠅模式的生存壽命。總而言之，我們的研究顯示粒線體的功能失調所引發的氧化壓力是造成SCA12的原因，以及降低氧化壓力為神經病理學更提供一可能的治療性方法。我們的結果也顯示Tws也參與在發育性的程式細胞死亡機制中。現在我們正在仔細研究Tws在細胞凋亡路徑上所扮演的上位性。除此之外，也正在探究中的是Tws可能參與調控的下游目標蛋白例如粒線體重塑蛋白PINK1以及Drp1。Item 熱休克蛋白過度表現及氧化壓力對SCA17細胞模式影響之研究(2009) 王品蓉; Pin-Rong Wang脊髓小腦運動失調症(spinocerebellar ataxias，簡稱SCAs)為體染色體顯性遺傳的神經退化性疾病，有超過28種的亞型。其中的遺傳性第十七型脊髓小腦運動失調症(SCA17)與染色體6q27位置TATA binding protein (TBP)基因的CAG三核苷重複擴增相關。突變的TBP蛋白具有延長的聚麩醯胺(polyQ)片段，可能導致蛋白質結構錯誤摺疊及聚集，而polyQ擴增造成的氧化壓力與疾病形成有關。當細胞處於氧化壓力下，會提升熱休克蛋白的表現，如HSPA5、HSPA8和HSPB1等監護蛋白(chaperones)，以便抵抗氧化壓力所造成的傷害。監護蛋白可經由穩定錯誤摺疊蛋白的結構，降低聚集的生成，來緩和polyQ突變蛋白的毒性。藉由熱休克蛋白和氧化壓力與SCA17的關連性做探討，我們可以更瞭解SCA17的致病機轉，有助於疾病的改善或治療策略的發展。藉誘導式細胞模式的建立，本篇研究結果顯示擴增polyQ的TBP蛋白聚集在細胞核中，且細胞週期呈現較高的sub G1%。表現擴增polyQ的TBP使細胞活性氧分子產量增加，且對staurosporine處理的敏感度提升及缺血清的耐受度下降。短暫表現TBP的細胞模式顯示，HSPA5、HSPA8和HSPB1的過度表現可以降低聚集的生成。Item 第十七型脊髓小腦運動失調症：遺傳檢測暨細胞模式之氧化壓力與細胞毒性研究(2008) 林佩瑛; Pei-Ying Lin第十七型脊髓小腦運動失調症（SCA17）為體染色體顯性遺傳的神經退化性疾病，起因於位在染色體 6q27 位置上的 TATA-binding protein（TBP）基因之 CAG/CAA 三核苷酸重複擴增，轉譯出帶有不正常的聚麩醯胺鏈（polyQ tract）的蛋白質產物，造成蛋白質構形改變而產生錯誤摺疊與聚集，導致疾病。目前SCA17致病機轉尚未完全瞭解，且尚無有效治療方法，加上疾病進程發展及變異極大，因此瞭解 TBP 基因 CAG 三核苷酸重複在族群中的分佈情形及探討可能致病機轉，將對發展疾病治療策略有所助益。本論文即以 SCA17 為主題，首先進行臺灣地區正常人族群、帕金森氏症患者族群、原發性顫抖症患者族群與其它神經退化性疾病患者族群的 TBP 基因CAG 三核苷酸重複遺傳分析，發現 CAG/CAA 重複次數的頻率主要集中在 36 個重複序列，並於 OPMD 及 TICS 疾病中發現有兩名不正常擴增的例子（44 and 45 repeats），顯示 TBP 基因重複擴增序列可能與其它神經疾病相關。另一部分利用年齡與性別配對的 SCA17 淋巴細胞株及建立誘導式 SCA17 細胞模式，檢視氧化壓力與熱休克蛋白在 SCA17 上扮演的角色。氧化劑 TBH 處理後兩種細胞模式皆顯示帶有 polyQ 擴增的細胞對氧化壓力的耐受性顯著差於帶有正常 TBP 的細胞，推論氧化壓力可能參與 SCA17 致病機轉。此外，在 SCA17 淋巴細胞株或誘導式 SCA17 細胞模式觀察到 HSPA8 與 HSPB1 表現量的改變，暗示此兩種熱休克蛋白亦可能參與 SCA17 致病機轉。最後，組蛋白去乙醯酶抑制劑 valproate 可增加帶有 polyQ 擴增細胞的存活率的發現，將有利於找出 SCA17 治療策略的目標。Item 環境壓力對人類神經細胞過度表現Protein Phosphatase 2A次單位PPP2R2B的影響(2009) 鄭琬婷; Cheng Wan-TingProtein phosphatase 2A (PP2A)是屬於serine/threonine去磷酸酶的一種，能調控細胞的生長、存活和凋亡。哺乳類動物中，Bβ次單位是PP2A在腦神經細胞中的專一表現的次表型。當Bβ基因有所損害或過度表現時，會造成神經細胞的病變。本論文分別將能專一表現於細胞質的Bβ1和專一表現於粒線體的Bβ2質體轉殖入神經腫瘤母細胞SK-N-SH中，建立穩定細胞株。利用H2O2和tert-butyl hydroperoxide (tBHP)作為氧化壓力來源，經48小時的處理後，Bβ2細胞株的存活率會急遽下降，由Annexin V和PI雙重染色的結果中證實是因細胞凋亡而降低存活率，但Bβ1細胞株則否。進一步轉殖LC3-EGFP質體和對酸性液泡胞器染色鑑定細胞自噬的發生，可以看出Bβ2細胞株本身便有些微細胞自噬體存在，當經氧化壓力後更引發Bβ2細胞株有更多細胞自噬體出現。但以細胞自噬抑制劑3-methyladenine (3-MA)對細胞作前處理24小時後，再經過氧化物處理，則各Bβ2細胞株的sub-G1期細胞比例皆會下降，而酸性液泡胞器的密度也明顯降低。證明氧化壓力所引起的細胞凋亡是經由細胞自噬路徑而產生。另利用降低培養液中的血清濃度模擬營養缺乏的情況，當無血清培養48小時的Bβ1細胞株之sub-G1期細胞比例較Bβ2細胞株高出許多，當血清濃度降低時，Bβ1細胞株的酸性液泡胞器也較Bβ2細胞株的密度高，證實營養缺乏在Bβ1細胞株所引發的細胞凋亡是經由細胞自噬。本論文針對過度表現PPP2R2B的細胞株分別於氧化壓力和營養缺乏的壓力下，細胞所產生的生理變化，模擬神經退化病變的產生，並瞭解病變機制，祈能對神經退化疾病的研究與治療有所助益。Item 人類遺傳疾病 第一部份：第八型脊髓小腦共濟失調症之分子遺傳及外遺傳研究 第二部份：台灣兩個Netherton徵候群病患家族之分子遺傳研究(2006) 黃淑宜; Shu-Yi Huang第一部份： 第八型脊髓小腦共濟失調症(SCA8)為退化性神經疾病，其特徵為小腦功能異常或亦包含其他部位的神經性異常，此疾病和染色體13q21位置的SCA8基因3'端CTG三核重複擴增相關。自1999年以來，SCA8基因的CTG擴增突變見於遺傳性及偶發性的運動失調患者，及帕金森氏症(PD)、阿茲海默氏症(AD)、Friedreich's運動失調症等退化性神經疾病及精神病患，甚至於極少數正常人。SCA8基因表現於腦的各部位，但轉錄的RNA裁接後並不具open reading frame。在人類及老鼠基因體中，SCA8基因的5'端皆和緊鄰的KLHL1基因(actin結合蛋白)的5'端互補，即SCA8轉錄物和KLHL1轉錄物互為antisense RNA，故SCA8基因可能藉此antisense RNA，來調節KLHL1基因的表現。先前本實驗室對SCA8致病基因進行遺傳分析，亦在台灣人的PD患者中發現的CTG重複擴增的現象(Wu et al., 2004)。本研究利用PCR-genotyping及DNA定序技術，擴大分析正常人族群、運動失調症患者、PD患者、AD患者及其他神經疾病族群SCA8基因CTG重複變異，結果共發現8位個體具CTG重複擴增的對偶基因，包括1位正常人、2位運動失調症患者、1位肌張力異常症患者、1位泛發性路易體患者及3位PD患者。RT-PCR分析正常人和CTG重複擴增病患的淋巴細胞株，發現SCA8基因和KLHL1基因皆有表現。進一步利用甲基化專一的PCR檢測及限制酵素的甲基化檢測，分析SCA8基因和KLHL1基因重疊序列上的CpG島的甲基化情形，發現在正常人和SCA8基因CTG重複擴增患者細胞中，均有不同程度的甲基化情形，但和SCA8基因CTG重複並無絕對相關性。在氧化壓力相關研究中，經由氧化劑t-butylhydroperoxide (TBH) 處理後，正常人及SCA8基因CTG重複擴增患者淋巴細胞株的WST-1細胞增生檢測、Trypan blue排除檢測、Superoxide dismutase assay結果，皆無明顯差異，故推論SCA8基因CTG重複擴增，並未影響細胞株的抗氧化能力。 第二部分： Netherton Syndrome (NS)是一種嚴重的體染色體隱性遺傳皮膚疾病，特色是先天性的紅皮症(congenital erythroderma)、特殊不正常的髮根結構(bamboo hair)及伴隨著體內IgE濃度提高的過敏性表現(atopic manifestations)。NS的病因是由於體內缺少絲胺酸蛋白抑制因子(serine protease inhibitor)的活性，而造成體內絲胺酸蛋白(serine protease)的活性異常提高。到目前為止，NS還沒有非常好的治療方法。NS的致病基因在2000年時被發現，位於染色體5q31-32的SPINK5 (serine protease inhibitor Kazal-type 5)基因，大小為61 kb，含有33個外顯子，其產物LEKTI蛋白，是一種絲胺酸蛋白抑制因子，廣泛的表現在人體各組織中，含有1064個胺基酸，有十五個potential inhibitory Kazal-type domains (D1–D15)，包括典型的Kazal-type domain D2和D15。和NS相關的SPINK5基因突變類型主要是產生了前成熟終止密碼(premature termination codon)，造成mRNA的不穩定，而使產物蛋白LEKTI (lympho-epithelial Kazal-type related inhibitor)的生成遽減。本研究目的為探討台灣兩個NS病患家族之分子致因。藉著PCR、定序來檢視兩位患者包括啟動子在內的SPINK5基因，找出和患者性狀相關的基因突變，並利用鄰近之6個微衛星序列及SPINK5基因上的5個SNP，對患者270家族進行連鎖分析。結果在患者2567的外顯子25上找到兩個突變點：已報導過的R790X及新發現的T808I，分別遺傳自患者的父親及母親。另一患者270為一新發現的R267Q變異的同型合子，此變異的Q對偶基因在正常人族群中約佔31%，但患者父親並未帶有此變異。進一步利用同步定量PCR (real-time PCR)，來檢測患者270是否有缺失突變(deletion)，結果顯示患者270在外顯子10的DNA套數和其啟動子鄰近序列(CA)20及D5S2013(為異型合子)相同，即排除其發生缺失突變的可能性。對於患者270在不符合遺傳定律之R267Q位點，推論可能發生基因轉換(gene conversion)。Item 第二及十七型脊髓小腦共濟失調症之分子檢測及SCA17 TBP擴增淋巴細胞的氧化壓力研究(2006) 陳玢璘; FL Chen摘要 脊髓小腦共濟失調症(SCA)為一群神經退化性疾病，其主要特徵為小腦功能異常，有時也會出現其他神經異常情況，其中第二型及十七型SCA (SCA2、SCA17)和蛋白轉譯區CAG三酸重複擴增相關。SCA17致病基因位於染色體6q27位置，其產物為轉譯起始因子TATA binding protein (TBP)。本研究利用基因型分析(genotyping)技術，首先分析台灣地區包括正常人族群、運動失調症患者、PD患者、AD患者、精神病患者及其他神經疾病族群SCA2、SCA17基因CAG重複範圍，結果於SCA2中發現1個位於正常及擴增範圍邊界的對偶基因(32個重複)，及4個擴增的致病對偶基因(35、40、48及49重複)，於SCA17中則未發現擴增的致病對偶基因，但觀察到5個邊界的對偶基因(44~46重複)。為了了解致病機轉，本研究建立了正常人及SCA17病人的EBV轉型淋巴細胞，並架構了包含 3~61 CAG三核重複的 TBP cDNA，表現於SK-N-SK細胞，利用氧化劑t-butylhydroperoxide (TBH)來檢測這些表現正常與擴增CAG三核重複的細胞對氧化壓力的忍受度。細胞存活及SOD活性定量結果顯示，與表現正常TBP基因的細胞相較，表現擴增TBP基因的細胞對於氧化壓力的忍受度會下降。利用定量蛋白體學方法，比較正常人及SCA17病人淋巴細胞的蛋白表現，初步結果發現一些熱休克蛋白及氧化壓力相關蛋白表現的變異。