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Item 水生食物網網絡中的寄生關係(2010) 陳宣汶寄生蟲是生態群聚中重要的一部分；但是直到最近，寄生蟲才較常被納入食物網的研究中。利用最近發表的文獻資料與相關的網絡分析工具，我的研究嘗試釐清寄生蟲在水生生態系的食物網網路中所扮演的角色。首先，本研究闡明寄生蟲在食物網中並非隨機分布的，而是與其宿主在食物網的位置有關。宿主在食物網的位置如果擁有較多的獵物種類、較靠近所有的獵物、或是能從食物網的底層往上累積較多的資源，其寄生蟲之種類多樣性便較高。相對的，若是宿主在食物網的位置有較多的掠食者、較靠近所有的掠食者、或是位在許多食物鏈路徑的必經之處，則此宿主的寄生蟲往上傳遞的比例越高。再者，本研究利用生態模式模擬食物網加入寄生蟲後，其網絡強固性之變化。首次將寄生蟲所造成之網絡強固性減少，分成網路的結構複雜性改變與寄生蟲特性兩個成因來探討；研究結果顯示造成食物網強固性減少的主因在於寄生蟲對宿主資源利用的可替代性較低。本研究建議利用寄生蟲對次級滅絕特別敏感的特性，可將寄生蟲當成食物網功能是否完整之領先指標。最後，本研究以過去食物網中物種的拓樸重要性指標為基礎，延伸加入食性營養關係中能量流動方向性的正負符號概念，發展出一套新的具正負符號的拓樸重要性指標。此一指標涵括食物網中的上行與下行效應、直接與間接作用，可用來定量物種間彼此的交互作用。應用此一新指標在包含寄生蟲的食物網資料上，可幫助我們進一步釐清寄生蟲在食物網中的角色與和其他功能群間的交互關係。Item 應用斑馬魚作為研究端腦突觸可塑性及智能障礙疾病的模式(2012) 吳民聰; Ming-Chong Ng硬骨魚類的端腦在學習與記憶的形成過程中扮演著重要的角色，其中又以端腦背側的外側區(Dl)與中側區(Dm)最為關鍵。利用螢光追蹤方法可發現，將螢光染劑置入D1區後，螢光物質會由Dl往Dm傳遞，這現象意味著兩者之間的神經纖維有緊密相連的關係，但目前探討Dl－Dm間突觸傳遞現象的研究還非常稀少。斑馬魚是一種廣泛應用於探討藥物成癮、焦慮以及學習和記憶等研究的模式動物。本論文的研究目的之一即以電生理技術，探討在斑馬魚端腦中Dl－Dm投射路徑的神經傳遞與突觸可塑(synaptic plasticity)現象。從結果可觀察到，在Dl給予一次電刺激能引發Dm產生一個負電位之電場電位(field potential, FP)，且該FP能被AMPA/kainate受器拮抗劑CNQX、0.5 mM Ca 2+、8.0 mM Mg 2+ 及TTX (0.5 μM)所阻斷；相反的，在無Mg 2+的人工腦脊髓液以及bicuculline中FP則能被提升並引發神經的猝發(bursting)現象。以上結果意味著興奮性與抑制性的神經傳遞作用皆可能具調節神經突觸的功能。為了探究這假說，本論文進一步探討了突觸可塑現象中的長期增益效應(LTP)與長期抑制效應(LTD) 。由結果發現，連續三次高頻刺激(每秒100Hz)或投予腺苷酸環化酶啟動劑Forskolin (50 μM) 15分鐘後皆可引發LTP現象，前者為NMDA受器依賴性LTP，而後者需要extracellular related-signal kinase (ERK)的參與。此外，投予代謝型谷氨酸受體興奮劑DHPG (25 μM) 10分鐘後，則會引發持續至少１小時的LTD現象 。由此可知，斑馬魚端腦Dl與Dm間的突觸連結為端腦突觸可塑性的關鍵角色，也在探討斑馬魚學習與記憶之神經機轉上提供了一個新的電生理模式。另外，斑馬魚在發生遺傳學等相關人類疾病的研究中也已成為不可或缺的動物模式。X染色體脆折症(Fragile X syndrome, FXS)是發生率較高的人類遺傳性智能遲滯疾病，伴隨著外型異常、認知功能以及行為障礙等症狀。FXS是由於FMR1基因發生突變造成其蛋白FMRP缺失所致，建立FXS的動物模式將有助於我們進一步瞭解致病的細胞與分子機制。因此，本論文的另一研究目的即為利用FMR1基因缺失斑馬魚，探究FMRP在行為及神經突觸可塑性中所扮演的角色。實驗結果顯示，成年斑馬魚因缺乏FMR1基因表達，而產生低焦慮、過動和抑制性逃避性學習障礙現象。而在電生理上，FMRP的缺失對於突觸傳遞功能並無明顯影響，但在突觸可塑性方面，相較於對照組，FMR1剔除斑馬魚端腦LTP的強度會減弱，相反的LTD則增強。綜合此研究的各項重要發現，我們認為FMR1基因剔除斑馬魚在未來應用上，除有助於我們瞭解FXS的致病機轉外，更能協助治療性藥物的開發。Item 以癌細胞株與動物模式探討吲哚結構化合物對於腫瘤細胞的生長抑制及其機轉(2011) 黃信銘; Sin-Ming Huang背景：前人研究指出，多種吲哚類化合物具有抑制細胞分裂的效果，進而導致癌細胞的細胞週期停滯和細胞凋亡。我們實驗室先前的研究證明，3-indole這個新穎的吲哚結構化合物可在30M的濃度下，藉由粒線體途徑（mitochondrial pathway）引起肺癌細胞凋亡，並在動物模式中抑制腫瘤生長。目的：本篇研究探討低濃度3-indole（10M）對癌細胞造成的生長抑制及其分子機轉。另外，我們也發展了另一個新穎的吲哚類化合物—SK228。我們利用細胞及動物模式，探討其對癌細胞生長的影響及其分子機轉。結果：在以10M 3-indole處理A549、CL1-1及H1437肺癌細胞株之後，發現癌細胞生長被抑制，並且造成細胞週期停滯於G1期。3-indole引起的DNA損傷由Comet assay所驗證，並且數種DNA損傷反應蛋白質及G1期調控蛋白質（例如RB、p53、p21和 SMAD3）在3-indole處理後表現量增加。我們進一步發現，3-indole也會引起DNA損傷反應路徑—ATM/ATR路徑的活化；另外，活性氧自由基（reactive oxygen species, ROS）的抑制劑rotenone能降低3-indole引起的DNA損傷和ATM/ATR反應路徑的活化。這些結果指出，ROS在3-indole引起的癌細胞生長抑制中，扮演重要的角色；動物異種移植（xenograft）實驗進一步證明，3-indole在細胞模式中活化的反應路徑，亦可見於動物模式中。在SK228的研究中，我們發現該化合物可有效的抑制肺癌及食道癌細胞生長，而對於正常肺纖維母細胞則無明顯影響。在以SK228處理過的細胞中，觀察到代表細胞凋亡的「細胞膜內膜外翻」的現象，指出SK228會引起細胞凋亡。我們進一步驗證了，SK228藉由與DNA的結合、鑲嵌及產生ROS而造成DNA的結構改變及損傷。SK228的處理會促進cytochrome c從粒線體釋放至細胞質中，以及caspase-3 和 caspase-9的活化，但不影響caspase-8的活性，並且這些反應可被ROS的抑制劑rotenone所抑制。另外，BCL-2家族的蛋白質表現量及粒線體外膜的完整性，亦受到SK228的影響。我們更進一步發現，SK228藉由降低FAK/paxillin路徑及RhoA的活性而抑制癌細胞的轉移能力。另外，動物實驗也證明SK228可有效抑制腫瘤細胞的生長，並且沒有引起明顯的體重變化或血液學、生化學上的明顯傷害。而且，藉由TUNEL assay和免疫組織化學染色證明，SK228可在動物模式中誘發癌細胞的細胞凋亡，進而抑制腫瘤生長。結論：本實驗證明，低濃度3-indole會藉由產生ROS而造成DNA損傷，並引起ATM/ATR路徑和TGF-β/SMAD路徑的活化，進而使細胞產生細胞週期G1期停滯現象。另外，SK228會藉由造成DNA損傷及ROS的產生而誘使癌細胞經由粒線體路徑進行細胞凋亡，並且也證明SK228可以在低濃度下有效抑制癌細胞的轉移能力。Item 以微矩陣比較基因體雜合方法偵測東西方肺癌族群新穎致癌基因及其機制與臨床探討(2011) 羅芳宜; Fang-Yi Lo近年研究顯示，腫瘤形成基因於不同種族之間存在差異性。因 此，鑑別各人種族群之間共通及具有差異性的基因群，是近代研究腫 瘤形成的重要課題。為了進一步探究腫瘤形成相關基因的分子機制， 本研究收集了40 對來自於臺灣肺癌病人（由台北榮民總醫院胸腔外 科許瀚水醫師提供檢體）及20 對來自於美國白種肺癌病人（由美國 芝加哥大學附設醫院胸腔外科Dr. Ravi Salgia 醫師提供檢體）的東西 方肺癌族群樣本，對其進行微矩陣比較基因體(array-comparative genomic hybridization, array-CGH) 的圖譜分析。本研究發現，於東方肺癌群族偵測到17 段染色體變異區域，涵蓋註解基因數為476；並 於西方肺癌群族偵測到20 段染色體變異區域，涵蓋註解基因數為 459。進一步針對本研究室先前分析出的expression array 基因群進行 一致性比對，篩選214 個於肺癌族群中基因結構變異及基因表現異常 趨勢相符的候選基因，並對候選基因進行基因已知功能的資料庫搜 尋。這些候選基因包含位於6p22.1 參與MAPK 路徑的 ZNF322A 基 因、位於10q24.1 參與Rho GTPase 路徑的 ARHGAP19 基因、位於 10q24.1 參與Wnt 路徑的 FRAT2 基因、以及位於17p13.3 功能與 motility 相關的 PAFAH1B1 基因。本研究對這四個極具潛力的候選 基因進行即時定量聚合酶鏈鎖反應系統、chromogenic in situ hybridization 方法、反轉錄即時定量聚合酶鏈鎖反應系統及免疫組織 染色法，確認候選候選基因於臨床肺癌樣本及肺癌細胞株中的基因變 異情形，其結果顯示候選候選基因其基因體套數及其 mRNA 表現量 皆於肺癌組織中高於正常組織 (P<0.001~P=0.06)。本研究亦利用反轉 錄即時定量聚合酶鏈鎖反應 及免疫組織染色法對101 位肺癌族群檢 測 PAFAH1B1 基因其 mRNA 及蛋白層次變異情形。結果發現 PAFAH1B1 基因於 mRNA 層次的過度表現頻率為62.4%，於蛋白層 次過度表現頻率為57.4%，且此基因於mRNA 及蛋白層次的過度表 現皆與病人的晚期具有相關性 (mRNA：P=0.008，蛋白層：P=0.008)， 且屬於腺細胞癌 (P=0.020) 及男性 (P=0.049) 的病人於蛋白層次的 過度表現具有較差的預後，顯示PAFAH1B1 基因於肺癌族群具有過 度表達的變異；細胞及動物實驗顯示過度表達PAFAH1B1 且可能促 進肺癌細胞轉移能力。本研究提供了第一個東西方肺癌族群新穎基因 變異資料庫，並以細胞、動物及臨床模式探討基因變異之致癌機轉。Item 研究果蠅PP2A B次單元twins的功能以及和Tau蛋白的交互作用(2010) 葉柏安; Po-An YehPR55Bbeta的表現異常，長久以來一直被認為是小腦萎縮12型的致病原因。隨後的研究指出，PR55Bbeta的表現量增加，極可能是小腦萎縮12型的致病原因。然而，可以模擬小腦萎縮12型的動物模式，一直沒被建立，以其在生物體內的致病機轉仍不明確。在本研究實驗中，PR55Bbeta過渡表現的果蠅模式被建立，而且其果蠅表現出運動力下降和神經病變的特徵。在研究PR55Bbeta和Tau蛋白之間的作用時，我意外的利用果蠅背甲上毛的數目，建立一個新穎的模式系統，可以穩定的檢測出Tau蛋白的磷酸化程度。研究期間，我更發現，磷酸化的Tau蛋白，有保護神經的功能，並且延長果蠅的壽命。相反的，無法磷酸的Tau蛋白，對神經的發育有不好的影響。最後，本研究也指出，PP2A的B次單元與細胞骨架的調控有關，為一個新發現的嶄新的功能。也許這些研究成果，可以連結小腦萎縮12型和阿茲海默症之間致病機轉的關連。Item 雙功能半纖維素分解酵素之基因選殖及其在木質纖維素分解之應用(2010) 白正康; Cheng-Kang Pai在品質較差而價格較低廉的草料中，往往含有較多難以被酵素分解的聚木糖與木質素等成分，這些成分的存在，間接影響了牛隻的飼料使用效率；然而，台灣水牛(Bubalus bubalus carabanesis)為一沼澤生活型的牛種，具有極高抵抗環境壓力與適應粗草料的特性。本論文從台灣水牛的瘤胃真菌Neocallmastix patriciarum S20中，選殖出一個具有雙功能的聚木糖分解酵素基因，名為xynS20E，並利用此酵素進行了以下的研究： 第一部分 – 從瘤胃真菌Neocallmastix patriciarum S20 cDNA庫中選殖具有雙功能聚木糖分解酵素的基因 本研究從N. patriciarum cDNA庫中選殖出一條具有乙醯化聚木糖酯酶活性與聚木糖酶活性的酵素基因，命名為 xynS20E。此基因具有一個2,016鹼基對的完整序列，其中包含162鹼基對的5’端非轉譯區與243鹼基對的3’端非轉譯區。此基因可轉譯出671個胺基酸的蛋白質，分子量約為72.4 kDa。其胺基酸序列中， N端具有一個碳水化合物酯酶第1族(carbohydrate esterase family 1)的功能性區域，而C端具有醣苷水解酶第11族(glycosyl hydrolase family 11)的功能性區域。此外，在這兩個功能性區域之間，則含有兩個真菌搭載結合蛋白第1型(fungal dockerin domain type I)之序列。後續實驗中，利用基因工程技術，將xynS20E選殖於pET29a表現載體，並利用大腸桿菌大量表達此帶有6個組胺酸之重組酵素，並藉由鎳離子親和性管柱純化，以製備XynS20E酵素。 第二部分 – 利用反應曲面法最佳化XynS20E之乙醯化聚木糖酯酶與雙功能聚木糖酶 反應曲面法搭配複合式中心設計法與統計迴歸分析可以有效率地得知酵素最佳反應活性的溫度與酸鹼值。利用此方法，得知XynS20E的乙醯化聚木糖酯酶在58°C與pH 8.2具有最佳比活性，為873.1±18.0 U/mg；XynS20E的聚木糖酶在49°C與pH 5.8達到最佳比活性，為128.7±32.9 U/mg。另外，乙醯化聚木糖酯酶功能性區域被獨立選殖於表現載體pET29a中，命名為AxeS20E。AxeS20E經由反應曲面法分析，於54.6°C與pH 7.8時具有最佳比活性；在80°C加熱120分鐘後，仍可保有85%以上的酵素活性，展現良好的耐熱穩定性。 第三部分 – 利用嵌合體酵素分解木質纖維素 XynCDBFV唯一已知具有高活性之聚木糖酶。應用反應曲面法更進一步地得知此酵素的最佳反應條件為55.3°C與pH 5.3，此反應條件下可測得比活性為9543.6±434.9 U/mg；進一步利用基因工程技術，分別將AxeS20E融合於XynCDBFV的N端與C端，並在兩個酵素之間設計了二個重複的GGGGS胺基酸鏈作為連結，產生兩個不同的嵌合體酵素(分別命名為AxeS20E-XynCDBFV和XynCDBFV-AxeS20E)。以反應曲面法分析此二嵌合體酵素，可得AxeS20E-XynCDBFV的最佳反應條件為62°C與pH 5.4，最佳比活性為6225.4±528.5 U/mg； XynCDBFV-AxeS20E的最佳反應條件為60°C與pH 5.4，最佳比活性為3945.6±154.1 U/mg。AxeS20E-XynCDBFV和XynCDBFV-AxeS20E在耐熱穩定性實驗中，在60°C環境中處理120分鐘後，分別保有60%與80%以上的原始活性；此雙功能融合酵素在協同效益的測試中，聚木糖分解能力較單一酵素單獨作用降低了8% ~ 30%酵素活性；將天然稻桿以酵素處理48小時後，以AxeS20E-XynCDBFV和XynCDBFV-AxeS20E處理分別較單一酵素處理時提高了1.3和1.2倍的還原糖濃度。 本研究為第一個從瘤胃真菌中發現具有乙醯化聚木糖酯酶與聚木糖酶的雙功能聚木糖分解酵素。結果亦顯示，反應曲面法搭配複合式中心設計法與統計迴歸分析提供了一個尋求反應條件最佳化的有利策略。研究並證實，AxeS20E具有良好的耐熱穩定性，此一特點將是應用於工業發酵中相當受到重視的一環；此外，人造雙功能嵌合體酵素展現了高於單一酵素的木質纖維素分解效率。Item Daphnephila 屬癭蚋蟲癭之生態生理特性研究(2011) 黃盟元; Meng-Yuan Huang造癭昆蟲會改變植物組織的生長與分化，產生的蟲癭可提供昆蟲營養及遮蔽，而造癭昆蟲也會造成植物組織內化學組成、色素蛋白複合體、光合作用效能等多方面的改變。本研究使用Daphnephila 屬之兩種癭蚋蟲癭，利用化學分析、氣體交換、葉綠素螢光、掃描式電子顯微鏡、共軛焦雷射掃描顯微鏡及反射光譜等，研究葉片癭蚋蟲癭和寄主植物的生態生理特性。結果顯示造癭昆蟲會改變葉片組織葉綠素的生合成及崩解途徑，由Chlide→ Phe→ Pchlide 改變為Chl→ Chlide→ Pchlide；在營養假說的基礎上，研究結果顯示蟲癭在寄主植物上可扮演基儲的角色；而反射光譜研究結果顯示，反射光譜指數與葉綠素螢光參數呈現正相關，反射光譜技術具有利用於蟲癭生態生理研究的潛力；由蟲癭及葉片抗氧化功能的分析結果顯示，蟲癭會提高抗氧化的能力來清除組織內增加的自由基。Item PPP2R2B基因：啟動子記述及Bβ1/Bβ2 isoform在神經退化的角色(2010) 林志信; Chih-Hsin LinPPP2R2B (亦稱為Bβ)廣泛表現在神經元，可調節去磷酸酶PP2A對tau及其他受質的去磷酸化作用。PPP2R2B基因5'端CAG重複擴增，導致體染色體顯性遺傳的神經退化性疾病第十二型小腦萎縮症。相反地，低轉錄活性且稀有短的等位基因，與台灣阿茲海默氏病和原發性顫抖症相關。本論文的第一部分在探討PPP2R2B基因CAG重複序列的角色，和鄰近cis要素及相關蛋白質調控PPP2R2B表現的情形。缺失/特定點突變、電腦模擬、cDNA 過度表現等實驗顯示，CREB1和SP1結合在CAG 重複的上游保守序列，來增加PPP2R2B的表現；然而TFAP4結合在CAG 重複的下游保守序列，來降低PPP2R2B的表現。DNA pull-down和染色質免疫沉澱-聚合酶連鎖反應等實驗進一步證實，CREB1、SP1和TFAP4結合在PPP2R2B起動子上。AT重複置換CAG重複的實驗顯示，CAG重複本身亦為一正調控PPP2R2B表現的cis要素。這些結果顯示CREB1、SP1和TFAP4在調節PPP2R2B表現中扮演角色，因此提供了一個調節PP2A活性的機制。論文的第二部分著重在建立穩定誘導表現Myc標籤的Bβ1/Bβ2細胞株，來探討Bβ調節的PP2A在神經退化中所扮演的角色。被誘導的Bβ1和Bβ2蛋白分別座落在細胞質和粒線體。Bβ細胞株的細胞週期分析顯示Bβ2表現的細胞，subG1和G2/M顯著增加，並伴隨著細胞存活率的顯著降低及cell division cycle (Cdc2)磷酸化的增加。表現Bβ2的細胞其特徵包括：活性氧自由基(ROS)和caspase 3活性增加、粒線體膜電位降低、Bax增加和cytochrome c由粒線體釋出至細胞質等，暗示Bβ2會誘導細胞自戕。抗氧化劑-tocopherol的添加可減弱ROS產生及cytochrome c釋放。總言之，這些結果顯示Bβ2能透過提升粒線體ROS的產生而誘導細胞凋亡。因此抑制Bβ2表現可能被發展為有潛能的治療策略，來治療與PP2A/Bβ2活性增加相關的神經退化性疾病。Item 第八型脊髓小腦運動失調症分子致病機轉之研究(2010) 陳怡辰; I-Cheng Chen脊髓小腦運動失調症 (Spinocerebellar ataxias)為一群顯性遺傳的神經退化性疾病，患者小腦及腦幹區域發生漸進式的神經退化，其中第八型脊髓小腦運動失調症 (SCA8)與染色體13q21位置的ATXN8OS基因3’端非轉譯區CTG三核苷重複擴增相關；除此之外，目前根據前人研究顯示SCA8疾病除了與ATXN8OS CTG方向的擴增有關，其反向ATXN8基因之CAG擴增也可能扮演重要的角色。目前SCA8的致病機轉尚未十分明確，本論文主要核心為研究SCA8疾病之遺傳與分子機轉。首先，我們利用人類胚胎腎細胞 (Human embryonic kidney 293 cell lines)建立可被誘導並穩定表現包含不同長度CTG擴增的ATXN8OS細胞株並進行ATXN8OS RNA表現之研究，實驗結果顯示帶有較長重複擴增之細胞，其ATXN8OS RNA被誘導表現的倍數較高，可能是由於其RNA比較穩定所導致。利用螢光原位雜交技術，我們也觀察到在帶有較長重複擴增之細胞中有RNA foci的形成。本論文的第二部份為檢測ATXN8OS、ATXN8及KLHL1 RNA在正常個體及ATXN8OS CTG擴增病人淋巴細胞株 (lymphoblastoid cell lines)中之表現，實驗結果發現在病人之淋巴細胞中ATXN8 RNA表現量比正常人高並達顯著差異，推測可能與存在ATXN8啟動子中的-62 G/A多型性點有關。另一方面，雖然之前的研究認為ATXN8OS基因不會進行轉譯，但我們實驗室的研究證實了ATXN8OS基因中的開放解讀架構 (open reading frame, ORF)可以透過特殊IRES (internal ribosome entry segment)的轉譯活性製造出蛋白質，因此，ATXN8OS ORF蛋白質轉譯的調控機制以及ORF蛋白質在病理機制當中可能扮演的角色亦是本論文著重的議題。本論文中我們利用ATXN8OS融合EGFP基因證實了ATXN8OS RNA具有轉譯的能力，除此之外我們利用ATXN8OS ORF蛋白質的抗體研究ORF蛋白質在不同細胞株中的表現，並更進一步利用質譜技術分析ORF蛋白質之胺基酸序列。我們也發現在病人的淋巴細胞株中，ATXN8OS ORF蛋白質的表現量高於正常人。預期本論文的實驗結果，將有助於了解SCA8的致病機轉，找尋適當的治療目標，並可以將結果應用到其他相關的神經退化性疾病中。Item 新穎抗癌藥物及其所影響之蛋白對於肺癌治療的效性探討(2010) 譚一泓; Yi-Hung Carol Tan目的：標靶治療是目前癌症治療的主要研究方向，大多數的肺癌患者對於化學療法或是放射線療法都有強烈的抗藥性，因此新穎的抗癌藥物以及新的治療目標是極需被開發研究的。在此論文的第一部分研究目的，希望鑑定新穎的小分子化合物OSU03013，是否可以作為肺癌新穎抗癌藥物。OSU03013其為舊藥celecoxib的衍生物，屬於cyclooxygenase (COX)-2的抑制劑。在攝護腺癌研究中證實OSU03013透過3-phosphoinositide- dependent kinase 1 (PDK1)/AKT訊息傳導路徑抑制腫瘤生長，此外，OSU03013也使用在乳癌的研究中。因此我們也希望能定義出OSU03013在肺癌中的目標蛋白及影響的生物路徑。此論文的第二部份是探討新穎c-Met抑制劑PHA665752對肺癌細胞生長及轉移的抑制作用，以及新穎治療目標基因Cbl (Casitas B-lineage lymphoma) 於肺癌病人檢體之突變情形。c-Cbl基因位於人類染色體11q23.3的位置，c-CBL蛋白目前已被發現主要參與細胞訊息傳導路徑以及酪氨酸激酶接受器（如：c-Met 和EGFR）的負調控角色，因此，本研究推測c-Cbl的突變或許是造成c-Met和EGFR過度表現的原因之一。此外，結合PHA665752 以及c-CBL 正常蛋白的共同抑制作用，或許可以成為新穎治療肺癌的策略。 實驗方法與設計：論文的第一部分，為了探討OSU03013是否有潛力成為新穎抗癌藥物，本研究利用肺癌細胞之毒殺作用及其細胞學鑑定，之後利用二維電泳、質譜分析等蛋白質體學的方法找尋藥物的目標及影響蛋白，並分析這些蛋白/訊息傳遞路徑與細胞生長調控的關係。論文的第二部分，利用肺癌細胞之毒殺作用來探討PHA665752的抑制效果，並利用基因定序及生物功能探討的方式，在總共一百一十九位來自台灣、美國白種人及黑人肺癌病人腫瘤組織中來研究c-Cbl的基因突變圖譜，並且在非小細胞肺癌細胞株中探討c-Cbl基因突變後影響細胞生長的狀況。此外，並利用c-Met抑制劑PHA665752及c-Cbl 正常基因轉染的共同處理，在細胞及動物實驗中來探討c-Met抑制劑及c-CBL正常蛋白對癌細胞的抑制作用。 結果：第一部分的結果指出OSU03013具有高度細胞選擇性毒殺作用，而此藥物對於肺正常細胞在相同濃度處理並沒有毒殺作用，所以是一個治療肺癌的潛力藥物。在細胞學鑑定實驗中，我們發現OSU03013的細胞致死劑量在48小時的測試下約1~4 M，會造成細胞週期停滯在間期一 (Gap 1, G1 arrest) 的現象；OSU03013在肺癌細胞同時也藉由內質網壓力效應去引發細胞凋亡 (apoptosis)。在蛋白質體學的實驗中，我們發現此藥物在肺癌細胞之目標蛋白包含了cAMP-dependent protein kinase inhibitor β form (PKIB, 激酶抑制蛋白)、數種G proteins (G蛋白)、數種Heat-shock proteins (熱休克蛋白)、Antioxidant enzymes (抗氧化蛋白)、及其他調控細胞生長、代謝的蛋白；這些蛋白有許多皆以Western blot (西方點墨法) 確認。經由分子模擬的實驗顯示，OSU03013會與ATP競爭然後與cAMP-dependent protein kinase (PKA)結合，並且抑制PKA的訊息傳導路徑，推測因此抑制了肺癌細胞生長。第二部份的結果指出，c-Met普遍過度表現於肺癌細胞中，而PHA665752對癌細胞具有毒殺作用、降低c-Met的表現，並且會引發早期細胞凋亡的機制。此外，一百一十九個肺癌病人樣本中，有一個已知的基因多型性變異 (signal nucleotide polymorphism) L620F以及八個位於表現子(exon)的c-Cbl突變型，其突變機率為百分之六點七。在三十七個台灣肺癌病人樣本中，有百分之二十一點六失去異合性(Loss of heterozygosity)的情形發生；另一方面，S80N/H94Y、Q249E、W802stop突變分別專一性發現於美國白種人、台灣人、非裔美人。在A549細胞中轉染此三種突變型c-CBL蛋白會導致細胞生長率以及移動能力的增加。最後，無論是在細胞或動物實驗中，將PHA665752以及c-CBL正常蛋白單獨或共同處理癌細胞有抑制其生長的現象，亦有抑制細胞轉移的情形。 結論：本研究為首篇在肺癌細胞中偵測OSU03013藥物之抑制癌細胞潛力，並由分子及蛋白質體學的研究結果發現此藥物會經由抑制PKA訊息傳導路徑來抑制癌細胞生長，並導致GSK3的去磷酸化，進而使在肺癌細胞中通常過度表現的-catenin被分解。此外，基於c-CBL可以負調控酪氨酸激酶接受器的表現，加上PHA665752亦可抑制c-Met在細胞中的過度表現，或許將來可以發展c-Cbl之基因治療，並且配合PHA665752的共同治療成為新的癌症治療方向。