學位論文
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Item 甲基轉移酵素在肺癌病人變異的臨床研究及分子機制以及其作為新穎標靶抗癌藥物之探討(2007) 林若凱; Ruo-Kai Lin抑癌基因的啟動子位置上若被過度甲基化，導致該基因的不表達，往往造成腫瘤的生成。負責將啟動子甲基化的酵素是甲基轉移酵素(DNA 5’-cytosine-methyltransferase, DNMT)，包括有DNMT1、DNMT3a及DNMT3b；但其在肺癌病人或細胞模式中並未有完整之變異分子機制與臨床研究，且其在癌症病人及細胞常發生不正常活化的改變，故引發出在癌症的治療中將 DNMT 作為癌症治療標靶的想法。本研究在所檢測的100位非小細胞肺癌病人發現，其DNMT1、DNMT3a及DNMT3b mRNA及protein在腫瘤組織比正常肺組織有顯著過度表達的情形，P值分別有0.002、0.034 及0.027；特別是在鱗狀上皮細胞癌 (squamous carcinoma, SQ) 的病人統計發現DNMT1的蛋白有過度表達的情形，P值達0.04。當這些病人同時過度表達DNMT1及DNMT3b時，則顯示與p16INK4a、RARβ及FHIT 抑癌基因啟動子過度甲基化有關，P值達0.006。在病人的腫瘤組織採組織染色質免疫沉澱分析 (tissue chromatin immunoprecipitation) 的確發現DNMT1及DNMT3b蛋白是結合在過度甲基化的p16INK4a、RARβ及FHIT 基因啟動子上。 為了檢查DNMTs過度表達的原因，於是在肺癌細胞株H1299（不含p53基因）送入DNMTs的一個可能的負調控蛋白Wild-type p53，來了解p53對DNMTs啟動子的影響。本研究採用營火蟲冷光啟動子活性分析，發現Wild-type p53可抑制DNMT1、DNMT3a及DNMT3b的啟動子活性，且在H1299肺癌細胞株長期表達Wild-type p53時，發現內生性的DNMTs之mRNA與蛋白表現量有下降的情形。而突變的p53蛋白則有增加其啟動子活性的趨勢。在病人組織樣本裡發現，這些有過度表達DNMT1的病人的確有p53 基因突變的情形，P值達0.016。這些病人同時以免疫組織染色來偵測DNMT1另一個可能的負調控蛋白RB，發現有過度表達DNMT1的病人同時伴隨著RB蛋白表達過低，P值達0.014。本研究進一步在正常的肺組織中利用組織染色質免疫沉澱分析，檢測到Wild-type p53及RB蛋白可以結合在DNMT1、DNMT3a及DNMT3b的啟動子上。DNMTs除了受轉錄的調控之外，此研究更發現DNMT1的過度表達的病人與吸煙有顯著的相關，P值達0.037。在正常肺細胞IMR-90及肺癌細胞H1299測試下發現，DNMT1、3a及3b的蛋白質表現量可受香煙致癌物4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK)的誘導而使其上升；此外，利用組織染色質免疫沉澱分析，發現在NNK處理細胞之後相較於控制組，檢測到DNMT1及DNMT3b蛋白結合在p16INK4a、RARβ及FHIT的啟動子上的程度顯著增加，該啟動子也的確被檢測是呈現過度甲基化。因此我們推測肺癌病人DNMTs的過度表達的原因可分為兩類：一是分子層次中的p53及RB變異有關，因其失去了負調控DNMT轉錄的能力；另一則是與吸煙有關，因香菸致癌物會誘導DNMTs的蛋白質表現量上升。而過度表達的DNMTs則使抑癌基因過度甲基化，最後導致肺癌的發生。 由於癌細胞基因體普遍出現CpG島群的甲基化異常而使抑癌基因失去活性的現象，因此抑制形成CpG島群的甲基化的藥物正可以作為恢復抑癌基因的表現及活化癌細胞中抑制癌症的重要路徑的新穎標靶藥物。而Mithramycin A (簡稱MMA)是一個會與富含GC及CG 序列的DNA 結合之藥物，因此本研究檢測癌細胞在經過MMA的處理之後，是否會抑制CpG島群甲基化的情形。我們發現當以低劑量(10 nM)的MMA處理癌細胞14天後，會減少轉移抑癌基因SLIT2及TIMP3的CpG島群過度甲基化的情形，並進而使這個具有抑制癌細胞轉移的SLIT2及TIMP3重現基因表達。同時間藉由膜穿透 (transwell) 實驗我們也發現MMA可降低具有高轉移能力的癌細胞CL1-5的穿越及移動能力。為了暸解MMA的作用途徑，我們使用西方點漬法發現MMA會使DNMT1蛋白明顯下降，但是DNMT1的基因表現不受影響。使用分子模擬 (molecular modeling) 發現DNMT的催化位置可被MMA藥劑所鍵結。總結研究結果發現，MMA具有去DNA甲基化及抑制癌細胞轉移的潛力。而抑制的機轉可能藉由抑制DNMT酵素催化能力並降低癌細胞中DNMT1的蛋白表達量，進而導致抑制癌細胞轉移的基因啟動子去甲基化且重新恢復表達。 本研究為首篇在肺癌病人或細胞模式針對三種主要甲基轉移酵素DNMT1, DNMT3a, DNMT3b完整之變異分子機制與臨床研究，且在肺癌細胞以GC DNA結合之MMA驗證其抑制 DNMT 作為癌症治療標靶的想法。Item 傅氏鳳尾蕨複合群生物學之研究(2007) 黃曜謀; Yao-Moan Huang傅氏鳳尾蕨Pteris fauriei Hieron.為日本、中國、琉球群島、臺灣及越南地區一普遍常綠性蕨類，在臺灣已被證實存在兩個分類群︰P. fauriei var. fauriei和P. fauriei var. minor Hieron.。兩者可藉由孢子大小、孢子囊內孢子數、藏精器內精子數、藏精器大小、生殖行為、及幼孢子體葉子形態來加以區別。測量U. Faurie在1904年所採及並被Hieronymus在1914年所發表的P. fauriei var. fauriei和P. fauriei var. minor模式標本之孢子大小，證實兩者分別為三倍體和二倍體。透過存活植株孢子囊內孢子數及蠟葉標本孢子大小，顯示兩種細胞型在臺灣的分布及其棲地類型：二倍體植株廣泛分布在臺灣及其鄰近島嶼，但未出現在臺灣中部或馬祖地區，相對地，三倍體植株未在台灣南部或台灣中部西側外島被發現，通常三倍體比二倍體生長在較高海拔地區及較冷涼的生育地。此二變種之atpB-rbcL非轉譯區間的基因序列完全一致，兩者該區段基因尚未發生分化現象。根據ISSR分子資料顯示大多數遺傳變異存在於族群之間，少數存在於族群之內。儘管P. fauriei var. fauriei行絕對無配生殖，卻有相當高的遺傳變異，多次獨立起源被視為無配生殖三倍體P. fauriei var. fauriei遺傳變異的主要來源。本研究證實三倍體Pteris fauriei var. fauriei與二倍體P. fauriei var. minor已分化出不同的細微特徵，顯著的生殖隔離模式，及分布和棲地類型的偏好；然而，P. fauriei var. fauriei和var. minor 卻無法由基因 (ISSR) 的相似性來加以區隔。Item 血管加壓素微量注入最後區引起大鼠心肺功能降低及其可能的訊息傳導路徑(2007) 楊舒如; Shu-Ju Yang最後區位於延腦的背面，缺乏血腦障壁，且富含血管加壓素接受器。以血管加壓素興奮最後區的神經元，會降低運動所引發的升壓作用。將血管加壓素微量注射到延腦腹外側會抑制呼吸、也會調節心血管的功能。本論文研究的目的是評估將血管加壓素注入到最後區是否會抑制呼吸與血壓，並研究其作用的可能機制。實驗選用Wistar品系的雄鼠，以氨基甲酸乙酯(urethane)麻醉，進行股動、靜脈插管，分別用來測量血壓與注射藥物，之後進行氣管插管，並切斷兩側迷走神經，經麻痺後接上人工呼吸器。然後將動物固定於腦定位儀，分離膈神經並記錄其活性，動物在維持高氧、正常二氧化碳濃度情況下進行實驗，少數實驗則是在高氧與提高二氧化碳濃度的情況下進行。微量注射三種不同劑量的血管加壓素，分別是1.5×10-5, 3.0×10-5 和 4.5×10-5 IU等劑量。本論文共完成四個實驗，觀察血管加壓素是否經由V1A接受器來抑制呼吸和血壓，並進一步研究這種抑制作用是否經由一連串細胞內的訊號傳遞作用，促使鉀離子孔道關閉，引起神經元去極化而使電壓閘門鈣離子孔道打開所引起。第一個實驗結果是將血管加壓素注入最後區，發現會抑制呼吸(包括膈神經高度降低與呼氣時間延長)與降低血壓，這種抑制作用呈現劑量反應，且是經由V1A接受器來達成；第二個實驗結果顯示血管加壓素注入最後區對呼吸與血壓的抑制作用，會被兩側孤獨徑核預處理利多卡因(lidocaine)或氯化鈷所阻斷，暗示抑制作用可能是藉由最後區投射到孤獨徑核的神經徑路來完成，不僅如此，注射血管加壓素所引起的抑制作用還會因二氧化碳濃度增加而減弱；這些結果顯示血管加壓素作用於最後區V1A接受器，主要是經由孤獨徑核進而抑制呼吸與血壓。 第三個實驗是要研究血管加壓素引起降壓作用的機制，也就是找出神經元內所發生的訊息傳導作用，在這個實驗，我先以V1A和磷脂酶C抑制劑 (PLC inhibitor)證明血管加壓素的作用是藉由V1A接受器和磷脂酶C，然後以微量注射技術，在相同的注射位置注入 BAPTA-AM (為一種胞內與胞外 Ca++螯合劑)或乙二醇-雙-(2-氨基乙基)四乙酸 (EGTA; 為一種胞外 Ca++螯合劑)，證明血管加壓素的降壓作用是因為Ca++從胞外進入胞內，使胞內Ca++增加所引起，在這個實驗還進一步利用各種不同的Ca++孔道阻斷劑，證明是Ca++經由 L- 型與P-/Q-型的Ca++孔道進入細胞，從另一組動物所得結果顯示，血管加壓素引起的降壓作用會被PKC預處裡所阻斷，但神經元外的鉀離子增多或以鉀離子孔道阻斷劑阻止鉀離子從細胞擴散出來，會模擬血管加壓素的降壓作用，這可能是神經元內的鉀離子增多、發生去極化所引起；第四個實驗是比較麩胺酸與血管加壓素作用於最後區產生降壓作用的機制是否相同，雖然麩胺酸的降壓作用也是使神經元內的Ca++增加，但是增加的機制卻不一樣，麩胺酸引起神經元內Ca++增加是動員細胞本身內部所儲存的Ca++，而不是從胞外進入，因此，與麩胺酸比較，血管加壓素引起Ca++進入神經元的作用是相當具有專一性的。這四個實驗所得結果充分說明血管加壓素的作用是，活化V1A接受器，經由細胞內的訊號傳遞作用，也就是經由PLC-DAG-PKC的路徑而關閉鉀離子孔道，促使神經去極化、電位升高，於是打開了L-型與P-/Q-型的Ca++電壓閘門孔道，讓Ca++進入神經細胞，而引起降壓作用。Item 辣椒素引起大鼠聲門關閉的神經調控機制(2005) 呂宜蓉; I-Jung Lu文獻上報導以辣椒素刺激肺C纖維，會引起呼吸暫停、血壓下降、心跳變慢三合一反射性反應，是一種防禦性保護機制，可以減緩有害物質的入侵及傷害。若是可以將刺激性物質阻擋使之不能進入，應該可以更加有效保護我們的呼吸系統，避免更多的侵害。喉部的聲門是控制呼吸道打開與關閉的閘門，也就是呼吸氣流必經的通路，控制喉部聲門外展 (開啟) 與內收 (關閉) 的神經是喉返神經。本研究目的在探討肺C纖維興奮對大鼠喉返神經呼吸活動的影響，藉以探討聲門是否會因為肺C纖維興奮而緊閉。 本研究選用Wistar品系雄性大鼠，利用辣椒素興奮肺C纖維，分為四部分實驗進行。第一，從右頸靜脈注入辣椒素以興奮肺C纖維，觀察甲杓肌活性之反應、聲門下壓力以及聲門外展與內收的變化，以研究聲門是否真的關閉；第二，投予辣椒素興奮肺C纖維，觀察喉返神經呼吸活動的反應；第三，同樣興奮肺C纖維，觀察控制聲門打開的喉返神經外展支吸氣活動以及控制聲門內收支的呼氣活動之變化；第四，研究單一喉返神經呼吸神經元對肺C纖維興奮的反應以解釋喉返神經的反應機制。 研究所得結果顯示，辣椒素由右頸靜脈注射進入右心房，以興奮肺C纖維時，會引起呼吸暫停、血壓降低及心跳變慢反應，在呼吸暫停與恢復期間，甲杓肌活動 (即TA EMG) 增強，導致聲帶內收、聲門緊緊關閉，使呼氣氣流無法順利通過聲門，引起聲門下壓力大大增加，以數位相機透過立體解剖顯微鏡，可以同步攝影，拍下實驗過程中，聲門的確在辣椒素的作用下緊緊關閉；整條喉返神經呼氣與吸氣活動都顯著增強，呼氣活動增強可能會促使聲門關閉，有利於保護肺與呼吸道免於再受到刺激性氣體的刺激，可是，在膈神經活動逐漸恢復時，整條喉返神經吸氣活動增強，使聲門展開，卻可能使肺與呼吸道更容易受到有害氣體的侵襲；這種不合理的反應，從同時記錄外展支與內收支對辣椒素的反應得到解釋，其實外展支的吸氣活動是降低的，但是由於喉返神經內收支在辣椒素作用下，非常興奮而轉變成為連續性活動，使得整條喉返神經呼吸活動外觀宛如增強似的，在內收支活動增強下，使內收支所支配的甲杓肌活動增強，於是聲門關閉。 到底辣椒素刺激後，喉返神經的反應機制是甚麼？這個部分是藉由分離並記錄喉返神經單根纖維，來解答整條喉返神經對辣椒素作用所引起的反應機制，這個實驗可以幫助我們更清楚了解當肺C纖維受到刺激時，喉返神經到底產生什麼樣的反應機制來因應並調控聲門的開啟與關閉。這個部分的實驗結果顯示，興奮肺C纖維會抑制吸氣神經纖維 (I) 和呼與吸神經纖維 (E-I)，卻會增強呼氣神經纖維 (E) 以及激活靜態神經纖維 (S) 參與放電反應，不僅如此，有些呼氣神經纖維還會提前於吸氣時活動起來，有些則轉變為連續性放電，這些吸氣相關神經細胞放電率受到抑制，呼氣神經細胞受到興奮、並提前活動，可充分說明喉返神經外展支與內收支的反應機制，以作為聲門因應辣椒素作用而關閉起來的神經生理學依據。 總之，以辣椒素興奮肺的C纖維，會引起反射性反應，導致聲門緊閉、呼吸暫停、降壓以及抑心作用，以降低有害氣體對呼吸道及肺更進一的傷害，這些反應對呼吸道與肺可能具有防禦性保護作用。Item 教學策略對論證形成的影響(2005) 黃翎斐摘 要 本研究旨在探究教師的教學策略對學生論證的影響，合作對象為一資深的國中教師-劉老師，劉老師以合作學習的方式進行教學已有相當長的時間，其教學活動以讓學生能進行討論及辯證為主。在本研究中，收集有課室觀察的錄影、教師晤談、及學生的學習單等多元資料，採用紮根理論為策略來分析資料，以了解教師在課室中採用何種策略引發學生的論證及促進學生完成論證。 研究中的分析方式是，首先採用Toulmin (1958)的論證定義選取教師與學生的論證片段以進行分析。在選擇論證片段後，以Kuhn和Toulmin對論證因子的定義為基礎，將所有的語句編碼，再分析所有的論證片段有無相同或相異之處，來發掘課室中論證的特徵及模式。在此過程中會持續比對教師的策略對學生論證的影響，並與教授及研究伙伴討論，隨時檢視資料，以確定歸納的教學策略正確無誤。最後，研究者參考Kuhn (1991)、Jimenez-Aleixandre (2005)和Osborne (2004)等人對論證能力及品質的標準，研擬一論證評鑑的標準，再對不同時期及不同類型的論證進行評鑑。 研究結果發現教師對於引發論證及促使論證完成有不同的策略來協助學生，而這些策略皆與培養學生的論證能力息息相關。在評鑑論證品質的部分，發現學生的論證在學期的前後表現有明顯的差異，學生的論證品質在後期有所增進。在本研究中也歸納出教師的提問會影響學生論證形成的模式，可分為主張式、選擇式及開放式論證，一般來說主張式論證中的提問較封閉，學生能發展的空間有限，因此以之前擬定的論證品質標準來評鑑學生論證，大多分布在第一、二級；選擇式論證因教師有所提示，學生的表現中庸；開放式論證中，學生的表現則呈現兩極化的分布。最後依據研究結果，對未來研究、教學提出建議。Item 退化性神經疾病：ＰＰＰ２Ｒ２Ｂ基因族群遺傳分析及分生研究(2005) 侯懿婷; Yi-Ting Hou脊髓小腦運動失調症(Spinocerebellar ataxias, SCAs)是一群體染色體顯性遺傳的神經退化性疾病，小腦功能異常是所有類型的共同症狀，且其中許多類型亦會引起中樞或是周邊神經系統的損傷。第十二型脊髓小腦運動失調症(SCA12)為PPP2R2B基因5'端CAG三核重複擴增的疾病。PPP2R2B基因會轉譯出一個專一表現在腦部的去磷酸PP2A (protein phosphotase 2A)的調控次單位Bβ，來調節PP2A對vimentin、histone-1、tau等蛋白的去磷酸化活性。本研究的目的在探討PPP2R2B基因CAG三核重複的遺傳及功能性角色。本研究分析了阿茲海默氏症、帕金森式氏症、運動失調症、精神病患者及正常人族群的PPP2R2B基因CAG三核重複的分佈頻率，發現CAG三核酸重複範圍沒有顯著差別，但阿茲海默氏症樣品群的(CAG)7的比例顯著高於其他樣品群。人類腦癌細胞株SK-N-SH、LA-N-1、IMR-32、胚胎腎細胞HEK-293及大鼠ST14A細胞的啟動子功能性分析顯示，CAG三核上游序列而非下游序列的缺失，會減低其啟動子活性。CAG三核重複的擴增(49及64個三核)會使PPP2R2B基因啟動子活性增加二至三倍，但罕見的(CAG)7 對偶基因表現的活性，僅為族群中常見的10、13、16個三核對偶基因的60%。CAG重複的變異可能影響鄰近啟動子element的相對距離，進而影響其啟動子活性。PPP2R2B基因啟動子(CAG)7 對偶基因可能為一功能性的多型性，影響個體對阿茲海默氏症的感受性。Item 台灣地區蝶類模式標本資料庫之建立-資料庫建構與資料互動(2005) 楊瀅涓台灣地區蝶種數量及特有性著稱於世，但在模式標本收藏多在國外，和以往缺乏整體性比較研究的情況下，導致學名因研究進展而不斷改變，造成許多蝶種分類地位及學名不穩定。近年來因人為開發而使蝶種日益稀少，為維持生物多樣性、擬定各種保育政策，釐清現行使用學名之謬誤，建立台灣地區蝶類模式標本資料庫，方可提供蝶類基本研究之必需基礎，並避免保育經營管理之浪費。 本研究欲蒐集蝶類同物異名原始文獻、模式標本資料後，使用實體－關係圖表示資料庫的概念設計，建立成台灣地區蝶類模式標本資料庫，並分析台灣地區蝶類發表年代和相關生物因子間的關係，以歸納晚近發表蝶種的生物特性，作為保育及研究的參考依據。