學位論文
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Item 人類遺傳疾病 第一部份：第二型黏多醣儲積症IDS基因的分子遺傳研究第二部份：家族性高膽固醇血症LDL受體基因突變的記述(2005) 張瑞宏; Chang, Jui-Hung第一部份：第二型黏多醣儲積症IDS基因的分子遺傳研究 摘 要 第二黏多醣儲積症(又稱Hunter syndrome)為X染色體隱性遺傳性疾病，其起因為缺乏分解heparan sulphate及dermatan sulphate的溶小體水解酵素iduronate-2-sulfatase (IDS)。全世界有接近三百種和MPS II相關的突變被報導。本研究利用單股核酸構形多型性及DNA定序等技術，對臺灣地區10位來自不同家庭且無血緣關係的MPS II患者進行分子致因研究，結果發現5種新穎的和5種已報導過的突變。合計先前臺灣14位MPS II患者的IDS基因變異分析所發現的10種突變，於24位的臺灣MPS II患者共發現20種突變，顯示IDS基因突變的高度異質性變化。R468Q和R468W突變分別發現於3位無血緣關係的患者，其發生率共佔25.0%。利用IDS基因鄰近的DXS1123、DXS1113二核重複多型性標記，建構突變基因的單套型，結果發現無血緣關係的R468Q突變為不同的起源，但無血緣關係的R468W突變則可能具相同的起源。患者1150的R468Q突變及患者710的I485R突變發生於精蟲形成的減數分裂。白血球酵素活性檢測顯示，正常人族群及女性MPS II突變基因攜帶者的IDS酵素活性範圍分別為19.2 ~ 70.6、8.4 ~ 26.6 nmol/h/mg cell protein，分佈範圍雖然有顯著差異，且女性攜帶者的平均酵素活性值亦低於正常人平均值的一半，但因為兩樣品群活性範圍的小部分重疊，故單獨檢測白血球酵素活性的數值，並不能用來判斷是否為突變基因攜帶者。此外本研究亦對所發現的17種胺基酸置換、缺失及終止密碼突變做進一步記述。突變的IDS cDNA轉移入COS-7細胞後，各突變的cDNA所表現的IDS活性，僅為野生型cDNA的0% ~ 3.9%，顯示突變的有害；但僅231del6突變造成mRNA的不穩定性(降低57%)。西方吸漬分析及共軛焦顯微鏡分析顯示，所檢測的11種單一胺基酸置換突變，僅K347E突變酵素成熟蛋白的大小及生成量與野生型酵素相似，其餘10種點突變前軀蛋白表面上正常，但成熟蛋白量降低或不具，顯示突變蛋白的正常成熟但無法正常運送至溶小體。所檢測的6個缺失、終止密碼突變中，1055del12和E521X的成熟不正常，共軛焦顯微鏡分析顯示截短的W267X和1184delG滯留在早期的vacuolar隔間。231del6和1421delAG則未看到表現的IDS蛋白，顯示突變IDS蛋白的不穩定性及被分解。在增進IDS重組蛋白在酵素替換治療應用的研究上，PEIa銜接的IDS較易被COS-7細胞分泌出去，被細胞內噬後亦生成有活性的酵素，但銜接的PEIa並沒有預期的 結合LRP的功能。黏多醣儲積症的分子遺傳學研究，可清楚的確認患者的分子致因並提供出生前及家族檢測。進一步的突變記述來釐清突變對IDS酵素活性及成熟的影響，可將此疾病的症狀和基因型相關聯，提供臨床上預後及治療方法的評估。 第二部份：家族性高膽固醇血症LDL受體基因突變的記述 摘要 家族性高膽固醇血症(familial hypercholesterolemia，簡稱FH)為一體染色體顯性遺傳疾病，患者因低密度脂蛋白(LDL)受體基因突變而導致血漿中LDL膽固醇值過高，易發展出早發性的冠狀心臟病。至今有超過840種分散在LDL受體基因上的缺失、插入、點突變、裁接突變被報導。先前本實驗室檢測了170位膽固醇濃度大於240 mg/dl的高脂血症患者LDL受體基因，於患者中發現10種可能和疾病相關的變異，包括兩種缺失變異(Del e3-5 和Del e6-8)及八種點變異(W-18X、D69N、R94H、E207K、C308Y、I402T、A410T、A696G)。本研究延續上述發現，對檢測到的變異作進一步的記敘。結果發現A696G cDNA質體轉移細胞LDL受體的表現量和活性與野生型受體相近。含D69N突變的cDNA質體表現時出現異常的中間型蛋白。含R94H、E207K、C308Y、I402T及A410T突變的LDL受體活性為野生型的20 ~ 64%。相對的，Del e3-5及Del e6-8突變的LDL受體活性僅為野生型的0 ~ 13%。D69N、R94H、E207K、C308Y及I402T等突變受體大部分停留在內質網，A410T及Del e6-8突變受體則停留在endosome/lysosome。此LDL受體的分生研究能清楚的確定病人的高血脂原因，可應用於出生前、家族分析及提供臨床上治療的評估。