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Item 山苦瓜活性物質TCD抑制人類胃癌細胞增生之作用機轉(2019) 駱曉彤; Lok, Hio-Tong動機: 先前文獻報導葫蘆烷三萜類化合物能抑制乳癌、子宮頸癌及前列腺癌細胞增生，具抗腫瘤的潛力。本研究室先前證實一種葫蘆烷三萜類化合物3β, 7β, 25-trihydroxycucurbita-5, 23-dien-19-al (TCD)能延滯細胞週期、引起細胞凋亡而抑制人類胃癌細胞株AGS細胞增生。然而其作用機轉未明，因此本研究接續探討TCD對於人類胃癌細胞株(AGS、MKN28、MKN45)增生的抑制效應及其誘導細胞凋亡之分子機制。 方法: 使用MTT測定TCD處理對於AGS、MKN45、MKN28存活率的影響。以流式細胞儀和西方墨點分析TCD處理AGS細胞對於細胞週期與細胞凋亡之相關蛋白表現量的影響。另外以西方墨點分析內質網壓力相關蛋白(GRP78 、p-PERK、IRE-1、XBP-1、ATF4、CHOP、p-JNK)的變化。 結果: 本實驗結果發現TCD可抑制胃癌細胞株AGS、MKN28、MKN45的增生，其IC50值分別為41, 40 和 45 μM。以TCD (30 μM)處理AGS細胞24 小時後，發現TCD經由抑制Cyclin E、Cyclin D1、CDK2、CDK4和p-Rb蛋白表現，造成細胞週期停滯於G1期。經TCD(30μM，24小時) 處理後顯著提升GRP78蛋白表現，激活未折疊蛋白反應中p-PERK、ATF-4、CHOP、p-JNK，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2及激活凋亡蛋白Bax，活化下游 cleaved caspase 9、cleaved caspase 3和 cleaved PARP，而引起細胞凋亡。另 TCD亦可促使MKN28和MKN45細胞的提升GRP78蛋白表現，推測亦可激活這兩株細胞的未折疊蛋白反應、引起內質網壓力。以外，從MTT細胞存活分析結果發現化療藥物SN38和TCD以等比例(AGS --1:200，MKN45--1:2000，MKN28--1:300) ，合併使用時，能有效抑制AGS、MKN28和MKN45細胞增生，分別具協同 (synergism)或加成(additive)作用。 結論: 由上述結果推論TCD可經由延滯細胞週期、引起內質網壓力導致細胞凋亡而抑制胃癌AGS細胞增生，具抗胃癌的潛力 。而TCD與SN38併用可協同或加成性的抑制胃癌細胞株增殖，推測TCD具有增強化療藥物作用的潛力，但仍待未來更多研究證實。Item 富含三萜類之山苦瓜葉萃取物對於四氯化碳誘導小鼠肝臟纖維化之保護效應(2018) 林于庭; Lin, Yu-Ting肝臟纖維化是由於慢性肝損傷造成大量的基質蛋白堆積在肝臟組織，為肝臟疾病最後一個可逆的階段，肝纖維化可能導致肝硬化或肝癌。山苦瓜具有多種藥理活性，其活性成分有酚類、黃酮類和三萜類等化合物。但山苦瓜三萜類化合物對於緩解肝纖維化的功效未明，因此本研究探討富含三萜類化合物之山苦瓜葉萃取物對於四氯化碳 (CCl4) 誘導肝纖維化的保護能力。 取得台灣山苦瓜 (花蓮一號) 並製備山苦瓜葉乙醇萃物 (bitter melon leaf extract, BMLE) 和富含三萜類之區分物 (triterpenoid-enriched extract, TEE)，以 LC/MS 鑑定 TEE 含有 Kuguacin R、Charantadiol A 以及3β, 7β, 25-trihydroxycucurbita-5, 23-dien-19-al (TCD) 葫蘆烷型三萜類化合物。給予 ICR 小鼠40% CCl4 (1 mL/kg) 和分別餵食 BMLE (100 mg/kg) 或 TEE (100 mg/kg) 八周，由肝臟組織切片結果發現 BMLE 與 TEE 均可減少肝臟細胞壞死、肝細胞氣球樣變性、發炎細胞聚集和膠原纖維蛋白沉積等現象。為進一步探討 TEE 的保護效應，給予 ICR 小鼠40% CCl4 (1 mL/kg) 和分別餵食 TEE (25、50、100、150 mg/kg) 與 silymarin (200 mg/kg) 作為對照組，為期九周，並於注射 CCl4 前一周預先給予 TEE 和 silymarin。 實驗結果顯示餵食 TEE (25、50、100、150 mg/kg) 均顯著降低 CCl4 誘導血清 AST、ALT 和肝脂堆積。肝臟組織染色結果觀察餵食 TEE (100、150 mg/kg) 組的肝臟門脈周邊橋連壞死 (periportal +/- bridging necrosis)、門脈發炎和纖維化的評分值顯著低於 CCl4 組，TEE (150 mg/kg) 組的肝小葉內變性和局部壞死的評分值顯著低於 CCl4 組，且隨著 TEE 劑量增加而抑制 α-SMA 的表現。整體 TEE (100、150 mg/kg) 組的組織學活性指數總評分顯著低於 CCl4組。從西方墨點法的結果觀察餵食 TEE (150 mg/kg) 顯著抑制肝臟纖維化蛋白質的 TGF-β1 和 α-SMA 表現。定量聚合酶連鎖反應的結果觀察餵食 TEE (25、50、100、150 mg/kg) 顯著抑制肝臟發炎的 TLR4 基因表現，TEE (25、50、150 mg/kg) 顯著抑制肝臟纖維化的 TIMP-1 基因表現。此外隨著 TEE 劑量增加而有逐漸減少發炎型 Ly6Chi 單核球聚集的趨勢，具抗發炎潛力。 綜合言之，TEE 具有緩解 CCl4 誘導小鼠肝纖維化之功效、減少肝臟發炎壞死，且隨著 TEE 劑量增加而有提升保護效應的趨勢，顯示富含三萜類化合物之山苦瓜葉萃取物具有抑制肝纖維化的潛力，是值得繼續研究開發的護肝素材。Item 苦瓜三萜類化合物TCD對人類胃癌AGS細胞的抗腫瘤效應及增加化學治療的敏感性(2017) 趙涓含; Chao, Chuan-Han先前文獻報導葫蘆烷三萜類化合物透過延滯細胞週期及促進細胞凋亡而抑制乳癌、子宮頸癌及前列腺癌的增生，並且也能夠增強子宮頸癌細胞KB-V1對化療藥物vinblastine和paclitaxel的敏感度。關於3β, 7β, 25-trihydroxycucurbita-5, 23-dien-19-al (TCD)對於胃癌細胞之影響的文獻報告卻相當有限，因此本研究以人類AGS胃癌細胞模式，探討自山苦瓜葉萃取純化分離的TCD對於抑制胃癌細胞增殖和增強AGS細胞對於順鉑(cisplatin)敏感度的效應。 實驗結果顯示，由細胞存活率MTT分析及群落形成分析發現TCD (>20 µM) 單獨處理能顯著抑制AGS細胞增生與細胞聚落生成。由劉氏染色法觀察發現TCD改變AGS細胞的細胞核/細胞質比例和細胞型態，因此以流式細胞儀分析細胞凋亡(apoptotic assay)和細胞週期(cell cycle)，發現30 µM TCD會將細胞週期延滯於G1期並引致細胞凋亡。以西方轉漬法觀察發現30 µM TCD造成AGS細胞凋亡相關蛋白caspase 9、caspase 3、和PARP表現量上升。另外觀察caspase酵素活性發現30 µM TCD能提高AGS細胞caspase 3活性。為觀察TCD是否具有增強cisplatin的藥效，合併使用IC20濃度的TCD (20 µM)與cisplatin (2 µM) 有效抑制AGS細胞增生且具協同作用(synergism)。在核質比及細胞型態的部分，cisplatin會使細胞脹大、DNA斷裂溢出細胞核，TCD會使細胞核聚縮並死亡，TCD/cisplatin併用時AGS細胞兼具上述特質。TCD/cisplatin (20 µM/ 2 µM)併用時顯著增加AGS細胞的凋亡比例,並顯著抑制cisplatin誘導之TNF-α mRNA表現。 以AGS細胞異種移植模式，將裸鼠分為4組分別為控制組、TCD (20 mg/kg)組、cisplatin (4mg/kg)組和TCD/cisplatin併用組。給予藥物後經35天後觀察發現：和控制組比較，不論是單獨給予TCD或cisplatin和TCD/cisplatin併用都能顯著降低腫瘤體積和重量。於試驗第20~35天實驗期間TCD/cisplatin組的腫瘤體積平均值均低於其他3組，但僅於第30天和TCD組達統計上的顯著差異。然而投予TCD和TCD/cisplatin不會影響裸鼠體重和脾臟相對重量，但cisplatin組的體重和脾臟相對重量則顯著低於控制組和TCD組，因此推測TCD具有抑制AGS腫瘤生長的效用且副作用較低。 綜論，在細胞實驗TCD可透過延滯細胞週期、引起細胞凋亡和抑制細胞增生，導致AGS細胞存活率下降。當TCD與cisplatin併用具有協同性的抑制AGS增殖的效果。在動物實驗TCD能抑制AGS腫瘤生長，顯示TCD具有協助治療胃癌的潛力，未來仍有待更多的研究以了解TCD的抗腫瘤作用機制與化療藥物併用的效果。 關鍵字：胃癌、順鉑、三萜類化合物、抑制增殖、增強化療敏感Item 探討苦瓜三萜類化合物對UVB刺激人類皮膚角質細胞的保護作用(2016) 鐘佩紋; Chong Pei Wen人體皮膚是保護身體抵抗外來傷害的第一道屏障，紫外線(UV) B（波長280-315 nm）能穿透皮膚表皮層(epidermis)，提高皮膚的氧化壓力與DNA損傷，誘導人類皮膚角質細胞(keratinocytes)產生發炎反應，導致皮膚光損傷(photodamage)及光老化(photoaging)。過度UVB曝露引起皮膚角質細胞大量凋亡而形成曬傷細胞(sunburn cells)可能導致皮膚癌。 山苦瓜(Momordica charantia L. var abbreviata Ser.)具有抗糖尿病、抗發炎、抗氧化、抗腫瘤、抗癌等藥理活性。本研究室先前研究發現山苦瓜葉甲醇粗萃物具有抑制酪胺酸酶活性、降低UVB誘導的活性氧物質等作用，因此本研究欲以細胞模式(cell-based assay)探討山苦瓜葉中三萜類化合物(triterpenoids)對於UVB刺激人類皮膚角質細胞（HaCaT細胞株）之保護作用。 本研究製備山苦瓜葉乙醇萃取物並取得5個區分物(fractions)，其中fraction 5對於UVB誘導HaCaT傷害具有良好的保護作用。自fraction 5純化得兩種葫蘆烷型(cucurbitane)三萜類化合物，分別為Kuguacin R和3, 7, 25-trihydroxycucurbita-5, 23-dien-19-al (TCD)。實驗結果證實Kuguacin R和TCD顯著提升UVB (20及30 mJ/cm2)照射後HaCaT細胞之存活率。兩種三萜類化合物都能顯著降低UVB誘導之細胞激素IL-1、IL-6、IL-8的生成，抑制MAPK蛋白質磷酸化與NF-κB活化，降低COX-2蛋白質含量並抑制PGE2生成，降低c-Jun蛋白質表現量，而TCD具顯著抑制c-Fos的能力，綜合以上結果，本研究顯示Kuguacin R和TCD具有抑制UVB誘導之發炎反應的功效。此外Kuguacin R和TCD具有抑制caspase-3活化及改善DNA斷裂的現象。另外in vitro經皮輸藥試驗確認Kuguacin R和TCD局部經皮吸收的能力。綜合上述結果，本研究推論Kuguacin R及TCD能減緩UVB造成的皮膚傷害，且有開發應用的潛力。