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PPP2R2B基因遺傳檢測,啟動子記述與單一鹼基多型性分析
(2007) 劉若芸; Ju-yun Liu
PPP2R2B基因轉譯出一個專一表現在腦部的去磷酸酶PP2A的調控次單位Bβ。當PPP2R2B基因5’端CAG三核苷酸不正常擴增時，會造成第十二型脊髓小腦運動失調症(SCA12)，但當抑制PP2A活性時，會使動物腦部Tau蛋白過度磷酸化，出現類阿茲海默氏症的症狀。先前本實驗室研究顯示，PPP2R2B基因上游-870 ~ +23序列可調節基因基礎表現，且台灣阿茲海默氏症患者中PPP2R2B基因5’端啟動子活性較低的(CAG)7等位基因頻率較正常人族群為高(2.8% vs. 0.2%)。本論文延續先前研究，首先擴大正常人及神經性疾病患者PPP2R2B基因CAG三核苷重複的遺傳資料庫，未發現任何擴增的等位基因，但在4位原發性顫抖症(2.0%)及1位舞蹈症(1.1%)患者，觀察到短的(CAG)5~7等位基因。其次分析PPP2R2B基因4 kb啟動子片段上4個單一鹼基多型性與阿茲海默氏症、原發性顫抖症感受性的相關性，各多型性基因型或等位基因在患者與正常人族群間沒有顯著差異，但-3170C/-2923A/-1905T/-428G單套型可能與阿茲海默氏症的感受性相關。在HEK-293、IMR-32細胞中，-4070 ~ +23的遠端啟動子的轉錄活性顯著低於-870 ~ +23近端啟動子，在SK-N-SH、HEK-293、IMR-32細胞中，(CAG)5~7的近端啟動子轉錄活性亦顯著低於(CAG)16者。
α-硫辛酸緩解高脂飲食及STZ誘發第二型糖尿病大鼠認知功能損傷之探討
(2018) 涂榕萱; Tu, Rong-Syuan
近年來臨床和流行病學研究發現，第二型糖尿病(T2DM)與阿茲海默症(AD)的發展有很高的相關性，有研究指出胰島素可參與AD相關蛋白如β-澱粉樣蛋白(Aβ)之調節。α-硫辛酸(ALA)已被證實可以改善糖尿病大鼠的胰島素阻抗。本研究探討ALA改善高脂飲食(HFD)及鏈脲佐菌素(STZ)誘導的糖尿病大鼠認知障礙、腦胰島素抵抗及突觸可塑性異常的效果。Wistar雄性大鼠給予HFD (60%脂肪卡路里) 4週後，以腹腔注射(ip) STZ (30mg/kg體重)誘發糖尿病。糖尿病大鼠每日管餵ALA 13週後，進行被動迴避試驗及Morris水迷宮試驗以評估大鼠認知功能。大鼠犧牲後採集血液及腦組織分析，並以Western blotting檢測海馬迴和皮質的胰島素訊息路徑、長期增益效應(LTP)及突觸可塑性相關蛋白的表現。被動迴避試驗與Morris水迷宮試驗結果顯示，給予ALA處理能顯著改善HFD/STZ誘導的糖尿病大鼠的認知功能障礙(p<0.05)。Western blotting分析結果顯示，給予ALA處理能顯著改善糖尿病大鼠海馬迴與皮質的突觸可塑性相關蛋白以及胰島素訊號傳導相關蛋白之表現(p<0.05)。在本研究結果發現，ALA可經由緩解糖尿病大鼠腦部胰島素阻抗來改善大腦神經突觸的可塑性及認知功能。目前ALA已是市面上的保健食品，希望可透過此研究讓ALA在未來也能作為阿茲海默症疾病的輔助用藥。
中藥複方製劑芍藥甘草湯和Coumarin-chalcone衍生物在Tau蛋白易聚集表現之阿茲海默氏症細胞模式中之療效
(2022) 林德嫻; Lin, Te-Hsien
阿茲海默氏症(Alzheimer’s disease, AD)為一種進行性且不可逆的神經退化性疾病，受損的記憶和認知能力會逐漸失常最終造成身體功能的完全喪失。AD病人腦中最主要的特徵為不正常的Amyoild β與Tau蛋白聚集形成的老化斑塊(Senile plaque)和神經纖維纏結(Neurofibrillary tangles)。神經纖維纏結主要組成是高度磷酸化的Tau蛋白，而Tau蛋白的病變不僅在AD病人，也在許多Tauopathy中見到。在大腦中由於錯誤折疊形成的蛋白堆積，引發許多病理事件，例如氧化壓力、神經發炎，或是與神經細胞功能相關的訊息傳遞障礙，降低神經細胞存活。本篇研究主要是利用人類胚胎腎細胞HEK-293和神經纖維瘤母細胞SH-SY5Y，表現易聚集特性的ΔK280 TauRD片段蛋白，作為評估中藥製劑芍藥甘草湯(SG-Tang)以及Coumarin-chalcone衍生物LM-021、LM-031和LMDS-1~4化合物，抑制蛋白聚集、抗氧化和神經保護性的情形。芍藥甘草湯製劑，由甘草與白芍以等比例製成，除了可有效降低以LPS/IFN-γ刺激後活化的BV-2微膠細胞所釋出的NO、TNF-α、IL-1β及IL-6等前驅發炎細胞因子外，並可抑制由於誘導表現ΔK280 TauRD蛋白而上升的BAD、BID、CASP3、CASP8和CYCS表現，來達到Tau蛋白聚集抑制和神經保護性。其中LM-021除了本身有化學伴護活性可直接抑制ΔK280 TauRD的聚集外，還可透過PKA、CaMKII、ERK等路徑活化CREB和下游的BDNF、BCL2表現，來展現其神經保護之功能。接著在ΔK280 TauRD-DsRed SH-SY5Y細胞中，觀察到LM-031可提升HSPB1伴護蛋白表現以降低Tau蛋白的錯誤折疊，以及藉由活化NRF2/NQO1/GCLC和CREB調控之BDNF/AKT/ERK/BCL2路徑，來達到抑制細胞凋亡和促進細胞存活之效果。最後，因LM-031可提升CREB依存的BDNF表現，利用虛擬篩選找出LM-031類似化合物LMDS-1~4，並進一步以TRKB與ligand作用的d5-domain (PDB 1hcf)，以分子模擬計算LM-031類似化合物與此蛋白片段的結合構形。細胞實驗結果顯示，LMDS-1和LMDS-2可經由TRKB/ERK和TRKB/PI3K/AKT訊息路徑，增加CREB磷酸化及其下游BDNF、BCL2基因表現。總結來說，本研究結果顯示芍藥甘草湯的抗氧化和抗發炎活性，可抑制神經細胞凋亡，在Tau蛋白聚集的細胞中展現其神經保護的能力，而Coumarin-chalcone衍生物LM-031、LM-021、LMDS-1、LMDS-2，具有活化HSPB1、NRF2及/或TRKB的作用，來降低Tau蛋白的錯誤摺疊、抑制細胞凋亡和促進神經細胞存活。以上這些研究結果顯示了芍藥甘草湯和Coumarin-chalcone衍生物，應用在AD治療上的潛能。
以amyloid-β 聚集為目標的阿茲海默氏症治療策略
(2013) 黃鉦翔; Chen-Hsiang Huang
阿茲海默氏症是最常見的老年癡呆症，主要臨床症狀包括Aβ胜肽聚集而成的細胞外澱粉樣蛋白斑與tau蛋白形成的細胞內神經纖維糾結。Aβ胜肽與tau蛋白的聚集往往是基於β-結構互相堆疊而形成。由於藉由破壞蛋白之間的氫鍵可能抑制蛋白聚集，故可能可以從吲哚、多酚類及其衍生物和中藥材篩選出潛在的Aβ胜肽聚集抑制劑。為了達成以上目的，本實驗利用thioflavin T分析法篩選人工合成之化合物。此外，於細胞層面上將Aβ42胜肽與GFP螢光蛋白的N端融合，用於反映Aβ42聚集之程度，並建立於SH-SY5Y細胞和293細胞中，篩選出Tet-On SH-SY5Y細胞與Tet-On 293細胞。Tet-On 293細胞被用來測試植物萃取物與天然或人工合成化合物，藉由綠色螢光訊號區別可延緩或抑制Aβ42聚集之抑制劑。本實驗使用Tet-On 293阿茲海默氏症細胞模式於高通量分析系統，並結合自動顯微鏡與圖像分析自動測試化合物的有效濃度。本實驗分析出10種植物萃取物與人工合成化合物，能提升Aβ42-GFP綠螢光之訊號，其中NTNU-043、NTNU-057、NTNU-059、NTNU-071、NC009-1以及NC009-2等較具潛力，能增加Hsp27蛋白表現，幫助抑制Aβ42聚集。
以tau 聚集為目標的阿茲海默氏症治療策略
(2013) 陳炫江; Hsuan-Chiang Chen
阿茲海默氏症是一種漸近性的神經退化性疾病，主要病理特徵包括細胞外間質的Aβ 胜肽堆積，及細胞內高度磷酸化tau 形成的神經纖維糾結。由於tau 聚集與阿茲海默氏症進程具相關性，因此透過抑制或消除tau 聚集或可保護受影響之神經細胞。本研究構築tau 蛋白微管結合重複區域(tauRD)之野生型(K18)及第280 位置賴胺酸缺失的促tau 聚集突變型(ΔK280)與DsRed 紅螢光蛋白融合之tauRD-DsRed基因，來建立誘導表現tauRD-DsRed 之Tet-On 293 與Tet-On SH-SY5Y 細胞，作為藥物篩檢平台，來篩檢可抑制tauRD 聚集的抑制物，並對這些具聚集抑制性的化合物或中草藥、植物萃取物等，檢測其神經保護機制。在Tet-On 293 細胞誘導tauRD-DsRed 蛋白表現後，ΔK280 突變型細胞螢光亮度較野生型細胞顯著減少。以剛果紅(正控制組)處理細胞後，突變型細胞的紅螢光亮度較野生型者更能有效提升。對於 293 促tau 聚集突變型細胞，在細胞數無顯著影響下，前處理 NC009-1、-2、-3、-6、-7 (吲哚基喹啉化合物)、NTNU-003、-008 (GSK-3β抑制劑類似物)、NH021、NTNU-043、-057、-059、-224、NTNU-309、 -313、-319、-331、-379 (中草藥或植物萃取液)等皆可顯著提升DsRed 紅螢光亮度。以維他命A 酸誘導ΔK280 促tau 聚集突變型SH-SY5Y 細胞神經分化後，螢光顯微影像分析顯示神經突觸生長性狀(包含總生長及突起數、分支數)較野生型K18 細胞顯著下降。以NC009-1、 -7 及NTNU-008 前處理突變型SH-SY5Y 細胞後，可顯著提升神經突觸總生長性狀，並可提升HSP27 蛋白(NC009-1、-7)或GRP 78、HSP27 蛋白(NTNU-008)的表現。
以阿茲海默氏症小鼠初級細胞培養和動物模式評估具TrkB促效劑潛力化合物之治療效果
(2021) 李佳瑜; Li, Chia-Yu
阿茲海默氏症(Alzheimer' s disease, AD)是目前最常見的神經退化性疾病之一，至今尚無顯著有效的治療方法，該疾病會導致認知和行為問題，不論是對於個人或社會都造成極大的負擔。AD在病理學上主要有兩個病徵：類澱粉蛋白(β-amyloid peptides , Aβ)堆積成的斑塊(plaques)及Tau蛋白的過度磷酸化所導致的神經纖維糾結(neurofibrillary tingles, NFTs)。許多研究顯示AD病患腦中之腦源性神經滋養因子(Brain-derived neurotrophic factor, BDNF)濃度較正常人低，且此現象可讓更多的Aβ生成。BDNF結合其受體原肌球蛋白相關激酶B(tropomyosin-related kinase B, TrkB)可調節長期增益效應(long-term potentiation, LTP)、突觸可塑性和神經元分化等，因此增強BDNF/TrkB訊號傳遞成為AD治療之潛力策略。7,8-二羥基黄酮(7,8-dihydroxyflavon, 7,8-DHF)是目前已知的最佳TrkB促效劑，可與細胞膜上的TrkB受體結合並引發受體之同源二聚化而啟動下游之訊息傳導。本研究使用7種與7,8-DHF結構類似，以及8種與Coumarin結構相似之化合物，篩選出具潛力之TrkB促效劑。首先確定Aβ25-35對小鼠海馬迴初級細胞培養的有效傷害濃度為5 µM，以建立AD體外模式篩選平台；我們以此平台篩選出最具神經保護之化合物ZN014進入動物實驗。我們以透過立體定位注射Aβ25-35到小鼠海馬迴CA1區建立AD小鼠模型，再評估7,8-DHF與ZN014對AD動物模式之效用，用藥期間進行一系列行為實驗，結果顯示ZN014可有效改善Aβ25-35所導致的短期記憶受損。在病理與分子機制分析上，我們利用免疫組織化學染色和西方墨點法分析小鼠海馬迴組織，結果表示ZN014可改善Aβ25-35所導致的神經細胞缺失，也可以緩解小鼠海馬迴的神經發炎。ZN014可能是藉由降低神經發炎以保護神經，進而改善因Aβ25-35所導致的記憶受損。綜合上述結果ZN014也許可以開發成具有AD治療潛力的藥物。
使用Aβ折疊報告細胞篩選靶向ERK及AMPK/EEF2K訊息的合成化合物作為新穎阿茲海默症治療策略
(2023) 祁舜慈; Chi, Shun-Tzu
阿茲海默症(Alzheimer’s disease, AD)是一種與年齡相關的神經退化性疾病，會逐漸的破壞記憶力以及學習能力，其主要病理特徵有大腦中β-澱粉樣蛋白(Aβ)堆積形成的斑塊，以及過度磷酸化tau蛋白所形成的神經纖維纏結。其中Aβ的堆積會損害神經元的突觸可塑性、增加細胞內的活性氧物質，並對神經元造成損害，因此開發AD藥物的其中一種方法，便是防止Aβ的堆積或阻斷Aβ寡聚體的神經毒性。研究有發現，在AD患者的CA1腦區中，編碼核糖體蛋白的基因受到異常的調節，其中與蛋白質的合成有關的真核延伸因子2 (Eukaryotic elongation factor 2, EEF2)在AD疾病中出現下調。EEF2在神經元的存活中起到重要的作用，可維持突觸可塑性。在真核細胞轉譯的過程中，EEF2的活性受到嚴格的控管。真核延伸因子2激酶(Eukaryotic elongation factor 2 kinase, EEF2K)藉磷酸化EEF2的T56位點抑制其活性，來調控轉譯的過程。EEF2K的活性受多種訊息路徑調控，如AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)及細胞外訊息調節激酶(Extracellular-signal regulated kinase, ERK)。AMPK的訊息傳導可透過磷酸化S398位點來活化EEF2K，促使EEF2磷酸化失活，從而減少蛋白質合成；而ERK可透過磷酸化S366位點來抑制EEF2K的活性，使EEF2去磷酸化活化，來促進蛋白質的合成，如：腦源性神經營養因子(Brain-derived neurotrophic factor, BDNF)。本論文利用Aβ折疊報導細胞Aβ-GFP SH-SY5Y細胞，探究吲哚衍生物(Indole derivatives: NC009-1, -3, -6, -11)及香豆素衍生物(Coumarin derivatives: LM-016, -021, -022, -036)，改善Aβ錯誤折疊的情形及神經保護作用。在八種測試的化合物中，除NC009-3外，所有化合物均符合Lipinski預測口服生物利用度的標準。根據計算出的極性表面積和血腦屏障滲透評分，八種化合物皆被預測為可滲透血腦屏障。所檢測的化合物皆可改善Aβ的錯誤折疊以及相關的氧化壓力。此外，前處理NC009-1、NC009-6及LM-021、LM-036可有效降低凋亡蛋白酶-3/6以及抑制乙醯膽鹼酯酶(Acetylcholinesterase, AChE)的活性，並促進神經突生長。接下來，為了解化合物促進細胞中蛋白質合成之作用機制，使用嘌呤酶素標定的轉譯的表面傳感(Surface sensing of translation, SUnSET)分析法，發現NC009-1、LM-021及LM-036的處理可增加細胞中新合成的蛋白質。此外，NC009-1增加了p-ERK (T202/Y204)和p-EEF2K (S366)的表達，LM-021降低了p-AMPK (T172)和p-EEF2K (S398)的表達，而LM-036同時作用於兩條途徑，增加EEF2K的S366磷酸化並減少S398磷酸化，從而導致EEF2K活性降低。隨後對應的p-EEF2 (T56)抑制活性的降低，增強了p-CREB (S133)及其下游BDNF、BCL2蛋白的表達，並促進神經突生長。研究結果可作為開發新穎且有潛能的阿茲海默症治療策略的參考。
使用模式鼠探討益生菌Lacticaseibacillus paracasei PS23對阿茲海默症的腸道微生物與海馬迴基因表現影響
(2023) 張清華; Chang, Ching-Hwa
阿茲海默症 (Alzheimer’s Disease, AD) 是最常見的神經退化性疾病之一，影響患者記憶、思考和行為。研究指出腸道和大腦之間有一個雙向的通道，稱為腸腦軸。近期越來越多研究指出腸道菌群的失調與AD有關聯，但腸道菌群在AD發病機制的作用仍有許多未明之處。此外有研究發現，益生菌可以通過腸腦軸改善腸道菌群的失調進而調整腦部功能。 Lacticaseibacillus paracasei PS23 是一種從健康人類糞便中分離出來的益生菌，多項研究指出PS23可以改善認知功能、衰老和憂鬱症。然而，PS23 對 AD 的影響仍未有報導。我們在稍早的研究中已經確認PS23可以改善AD小鼠之認知功能，在此研究中，我們分析益生菌 PS23 是否改變AD模式小鼠腸道微生物群組成和海馬迴基因表達。我們發現PS23能提升AD小鼠代謝、免疫功能、以及短鏈脂肪酸相關的腸道微生物群豐度。另外，PS23活菌也有提升短鏈脂肪酸的濃度。PS23活菌以及熱殺菌皆有改變SRP54、P2Y2R、growth hormone、prolactin的基因表達程度。因此，我們推測PS23活菌可以透過增加短鏈脂肪酸而降低AD小鼠中的發炎，而PS23熱殺菌可能以透過提升growth hormone來增加神經新生，而PS23活菌以及熱殺菌可能透過增加prolactin表現量而增加記憶及認知功能以改善AD之病徵。綜合上述結果，我們認為PS23具有預防與治療AD的潛力。
利用Aβ折疊報導細胞篩選黃酮及香豆素衍生物作為促效劑標的BDNF受體TRKB的阿茲海默症治療策略
(2021) 黃鏡嘉; Huang, Ching-Chia
阿茲海默症(AD)是與記憶缺陷和認知功能下降相關的進行性神經退行性疾病。病理學上AD的特徵是大腦中存在澱粉樣蛋白β (Aβ)聚集體(澱粉樣斑塊)和由高磷酸化的Tau蛋白形成的神經原纖維纏結(NFT)。腦源性神經營養因子(BDNF)是神經營養蛋白家族的成員，以高親和力與原肌球蛋白相關的受體激酶B (TRKB)結合，活化下游信號傳導，來促進神經元的存活、分化和神經可塑性。已經發現AD患者的腦中BDNF和TRKB表達水平降低，並且BDNF降低和TRKB受損導致AD中的神經變性。AD小鼠模型的海馬迴中施用TRKB特異性促效劑7,8-二羥基黃酮(7,8-DHF)，可改善了空間記憶並降低樹突損傷，表明TRKB信號傳導增強，為有希望的AD治療策略。本研究使用表達Aβ-GFP的人類神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞，對15種黃酮和香豆素衍生物，進行Aβ聚集抑制性及神經保護性的評估。在測試的化合物中，ZN006、ZN013、ZN014、ZN015可抑制Aβ蛋白聚集、降低活性氧化物(ROS)、及抑制乙醯膽鹼脂酶(Acetylcholinesterase)活性，其中ZN014、ZN015並能抑制凋亡蛋白酶-1 (Caspase-1)活性及促進神經突生長(Neurite outgrowth)。在TRKB訊息傳遞路徑上，ZN014、ZN015可透過TRKB受體的Y516、Y817磷酸化，及下游ERK激酶T202/Y204磷酸化、AKT激酶S473磷酸化的活化，進一步促進轉錄因子CREB的S133磷酸化，來增強神經營養因子BDNF及抗凋亡蛋白BCL2的表現。RNA干擾(RNAi)靜默TRKB基因表現的實驗，驗證了這兩種化合物經由TRKB訊息傳遞的神經保護性。總言之，研究結果顯示ZN014和ZN015可抑制氧化壓力及乙醯膽鹼脂酶活性，並增強BDNF-TRKB訊息，來降低Aβ毒性，有潛能應用在AD的治療上。
利用熱力學積分分子動力學模擬計算GSK-3β 激酶與配體複合體之相對結合自由能：含嘧啶環的化合物
(2015) 劉安倫; Liu, An-Lun
在阿茲海默症可能的發病機制探討中，人體腦部神經元中GSK-3β激酶蛋白過度磷酸化下游的tau蛋白被認為是其中一種主要的原因。透過抑制GSK-3β激酶可能減緩阿茲海默症症狀，甚至能達到治療成效。由於小分子與蛋白複合體間的結合自由能是反映抑制強度的重要物理量，本研究中使用熱力學積分分子動力學模擬輔助設計GSK-3β的競爭性抑制劑。此方法是利用參考分子與待測分子分別對目標蛋白的結合情況，去預測相對結合自由能(ΔΔG)。我們首先計算已知結晶構型及結合親和力的抑制劑。計算的結果與實驗值相差0.4 kcal/mol，顯示結果與實驗值吻合。接著我們利用同樣的計算流程預測自資料庫挑出的9個分子與已知結晶構型的參考分子ZRM之ΔΔG值。一開始本研究先假定分子的結合模式與ZRM相同，在這9個分子的計算結果當中，計算值均落在1.4-5.0 kcal/mol，是值得進行實驗測試的化合物。此外，本研究也探討了利用分子嵌合計算與這些結合構型的ΔΔG值，結果顯示9個分子有8個以原先類似ZRM的結合模式相同。這些預測小分子與蛋白之結合親和力與結合模式的結果將能輔助類似物分子抑制劑的設計。
咖啡酸預防高胰島素血症大鼠阿茲海默症之機制
(2014) 鄭勤巧; TEE QIN QIAO
高脂飲食易促使肥胖、周邊胰島素阻抗及糖尿病等疾病進程，接續造成腦部胰島素阻抗而最終導致阿茲海默症(Alzheimer’s disease, AD)的發生。流行病學研究顯示，第二型糖尿病病患罹患阿茲海默症的機率較正常人高出兩到三倍。本實驗室先前以胰島素阻抗細胞模式篩選出本實驗樣品--咖啡酸(caffeic acid)，且在動物實驗中發現其具有改善腦部醣類代謝及胰島素訊息傳遞的效果。因此，本研究進一步探討咖啡酸可否預防以高脂飲食(脂質佔總熱量60%)誘導高胰島素血症大鼠阿茲海默症的發生，並釐清其機制。水迷宮試驗結果顯示，合併管餵咖啡酸(30mg/ kg b.w.) 30週後可顯著改善高胰島素血症大鼠的學習及記憶能力；在抗氧化系統中，咖啡酸可預防高脂飲食所造成的海馬迴及大腦皮質超氧岐化酶 (superoxide dismutase, SOD) 失活，並可增加大腦皮質麩胱甘肽 (glutathione) 捕捉自由基的能力；以西方點墨法分析發現，咖啡酸可增加高胰島素血症大鼠海馬迴胰島素訊息傳遞下游路徑蛋白：蛋白激酶B (p-AKT/PKB)、磷酸化肝醣合成酶 (phospho-glycogen synthase 3β, p-GSK3β) 的表現量，以降低tau蛋白的過度磷酸化。此外，咖啡酸可降低海馬迴類澱粉蛋白前驅物 (amyloid protein precursor, APP)及APP β部位切割酵素 (β-site APP cleaving enzyme, BACE) 的表現量，進而減少海馬迴中類澱粉蛋白1-42 (β-amyloid 1-42, Aβ 1-42) 的堆積。在大腦皮質部分，咖啡酸可提高具有神經保護功效的腦源性神經滋養因子 (brain-derived neurotrophic factor, BDNF) 及突觸相關蛋白的表現，且有助於降低胰島素降解酵素 (insulin degrading enzyme, IDE) 因代償作用的過量表現。由以上結果推測，咖啡酸可透過改善胰島素/瘦體素訊息傳遞、降低神經細胞氧化壓力、減少tau蛋白過度磷酸化、阻斷類澱粉蛋白生成及增加神經滋養因子等神經保護機制，以有效預防阿茲海默症的發生。
應用果蠅模式篩選中草藥抑肝散(順寧意)緩解阿茲海默氏症的醫療潛力
(2021) 鄭詠馨; Jheng, Yong-Sin
傳統中藥抑肝散過去常用於治療神經退行性疾病、精神官能症、失眠。而阿茲海默氏症是失智症裡各類型中最常見的，主要是以澱粉樣蛋白β (Aβ) 的異常堆積和Tau蛋白的過度磷酸化造成腦部細胞損傷有關。本文利用DPPH檢測中藥抑肝散的自由基清除與抗氧化能力；再透過細胞存活率分析法(MTT assay)檢視中藥抑肝散對於SH-SY5Y神經細胞的保護作用，實驗結果顯示中藥抑肝散具有相當高的自由基清除與抗氧化能力，對於SH-SY5Y神經細胞也有顯著的保護作用。本文利用轉基因果蠅表現Aβ42和hTauR406W毒性蛋白質作為AD動物模式，研究中藥抑肝散對人類Aβ 和人類Tau蛋白過度累積所引發的神經毒性在果蠅上是否具有保護作用。由於人類Aβ蛋白過度表現的Aβ42 會產生複眼退化；因此利用綠螢光蛋白觀察Aβ42 表現所造成的複眼退化，以及計算hTauR406W的背甲剛毛數目，可以評估中藥抑肝散對於Aβ和Tau蛋白過度表現果蠅的神經保護作用，實驗結果顯示中藥抑肝散可以緩解Aβ42 複眼的退化；另外也可以顯著緩解hTauR406W果蠅的背甲剛毛退化。此外，透過高靈敏的免疫磁減量(ImmunoMagnetic Reduction，IMR)技術可以評估Aβ42的Aβ蛋白表現，以及評估hTauR406W的Tau蛋白表現，結果顯示中藥抑肝散可以降低Aβ蛋白以及Tau蛋白的表現。歸納研究結果，可以說明中藥抑肝散對於緩解阿茲海默氏症可能具有替代醫療效果。
探討神經醯胺對CaMKII相關訊息傳遞路徑和學習記憶的影響
(2021) 葉佳旻; Yeh, Chia-Min
神經醯胺是一種由鞘胺醇鹼骨架和不同碳鏈長度的脂肪酸組成的神經脂質，在許多生理過程中扮演非常重要的角色，例如調控訊號傳遞路徑。在過去的研究中，我們發現在野生型小鼠離乳後給予神經醯胺能增進成年後的記憶行為，利用初級培養的神經細胞也發現神經醯胺可增加CaMKII的磷酸化，CaMKII是一個與學習與記憶相關的蛋白質。本研究即探討神經醯胺在細胞層級的作用機制，以及利用阿茲海默症模式小鼠J20做為動物模式，探討在其離乳後給予神經醯胺是否可改善記憶缺失。結果顯示初級培養神經細胞給予神經醯胺刺激後，會使CaMKII磷酸化，且活化轉錄因子CREB以及活化Erk。而以目前的研究參數進行的實驗則發現神經醯胺並不會使神經細胞中鈣離子濃度產生變化。另外在更下游與表觀遺傳相關修飾的研究則發現給予神經醯胺可以使H3K4甲基化成H3K4 me3，並提高Egr1的表現量。將神經醯胺以皮下注射給予阿茲海默症模式小鼠J20，對小鼠的一些基本參數如體重、葡萄糖耐受性、發炎指標GOT、GPT以及組織切片觀察，發現給予神經醯胺並不影響上述生理參數。在動物行為方面，神經醯胺並不改善小鼠的焦慮行為，但可觀察到透過莫氏水迷津所檢測之短期空間記憶有顯著的進步。綜合以上，神經醯胺能使神經細胞中和記憶相關的蛋白質活化，且改善阿茲海默症模式小鼠J20的短期空間記憶，表示早期給予神經醯胺可能有助於學習與記憶的能力。
探討黃芩素衍生物於神經細胞及阿茲海默動物模式小鼠之作用
(2024) 吳嘉旋; Wu, Chia-Hsuan
篩選能改善類澱粉蛋白所引發病理的神經傳遞之中草藥
(2014) 李智翰; Chih-Han Lee
阿茲海默症是世界上最普及的一種失智症，其中有兩個主要病徵與該疾病漸進的神經退化失調有關：細胞外由類澱粉蛋白貝塔(Aβ)組成的斑塊，以及細胞內由過度磷酸化的tau所導致的神經原纖維纏結。近期研究指出Aβ蛋白會減低第一型與第二型囊泡麩氨酸轉運體(vGLUT1/2)在前突觸麩氨酸性區的表現，以及抑制麩氨酸被星狀細胞回收清除。這使得過多的麩氨酸累積在突觸間隙而後引發神經興奮毒性。然而Aβ蛋白過度活化N-甲基-D-天門冬胺酸受體(NMDAR)的現象可被人工合成的NMDAR拮抗藥物美金剛(memantine)所改善。因此找出麩氨酸受體的拮抗劑被視為Aβ蛋白所引發之異常現象的治療策略。於本研究中，我們試圖以小鼠初級大腦皮質神經細胞篩選中草藥以找出能改善Aβ蛋白導致的過量麩氨酸神經傳遞的非人工合成之天然成分。由免疫細胞化學法得知，vGLUT1/2染色呈現幾乎一致的麩氨酸性神經細胞群，突觸結合蛋白(synaptotagmin)染色亦在這些細胞之間呈現神經網絡的形式。而該初級神經細胞的特徵也透過西方墨點法中的抗體訊號如第三型貝塔微管蛋白、PSD-95蛋白以及α-氨基烴甲基嘿挫丙酸型受體(AMPAR)得以確認。為了在篩選中草藥的過程中能偵測並量化受Aβ蛋白刺激所造成的膜電位變化，DiBAC4(3)，一個慢反應電位敏感染劑，被用來做為藥物篩選的工具。DiBAC4(3)可進入去極化細胞並與胞內或膜蛋白結合隨後引發增加的紅螢光強度。去極化程度越高紅螢光越強，反之過極化則導致紅螢光減弱。為了建立DiBAC4(3)的中草藥篩選平台，我們對初級神經細胞刺激氯化鉀、麩氨酸以及Aβ蛋白後發現DiBAC4(3)螢光強度如預期般地增強。此外我們藉由DiBAC4(3)方法發現於Aβ蛋白刺激前加入memantine可減弱Aβ蛋白所導致的去極化現象。由上述結果可知DiBAC4(3)的中草藥篩選平台已被成功建立。在篩藥之前，我們亦先量測了處理不同濃度的中草藥對細胞存活的半抑制濃度(IC50)以便日後篩藥。在我們近期研究中，我們找到一些能抑制Aβ蛋白所引發的過度去極化現象的中草藥，也希望之後能找出該中草藥之有效成分如何參與阿茲海默病理現象中的麩氨酸受體訊息傳遞機轉。
評估TrKB之潛力促效劑於阿茲海默氏症細胞與動物模式之神經保護效果
(2019) 范家豪; Fan, Chia-Hao
阿茲海默氏症(Alzheimer’s disease, AD)是目前最常見的神經退化性疾病之一，至今尚無顯著有效的治療方法。這種全球性的健康問題不論是對於個人或社會都有極大的影響。AD在病理學上主要有兩個病徵：類澱粉蛋白(β-amyloid peptides, Aβ)堆積成的斑塊(plaques)以及Tau蛋白過度磷酸化所導致的神經纖維糾結(neuro-fibrillary tangles, NFTs)。許多研究證實，在失智症病患腦中之腦源性神經滋養因子(Brain-derived neurotrophic factor, BDNF)濃度較低，且此現象可令更多的Aβ生成。BDNF及其受體原肌球蛋白相關激酶B(tropo-myosin-related kinase B, TrkB)，可調節長期增益效應(LTP)、長期抑制效應(long-term depre-ssion, LTD)、軸突出芽、樹突增生、突觸可塑性和神經元分化。7,8-二羥基黃酮(7,8-dihydroxyflavon, 7,8-DHF)是目前已知的TrkB促效劑，可與細胞膜上的TrkB受體結合並引發同源二聚化，啟動下游之訊息傳導。本研究是使用結構與7,8-DHF類似之12種新型的TrkB促效劑，經過MTT實驗評估發現12種促效劑對神經細胞都無明顯細胞毒性及神經突生長之影響。接著於小鼠海馬迴細胞初級培養給予Aβ25-35誘導神經損傷作為AD模式篩選平台，結果顯示LMDS-1能有效緩解因Aβ25-35寡聚體所導致的神經突長度及分支數目降低之現象，因此選擇LMDS-1進入動物實驗測試，並以7,8-DHF為正控制組。先利用立體定位注射Aβ25-35至小鼠海馬迴CA1區域以建立AD模式動物，再給予7,8-DHF或LMDS-1之處理，並於期間進行一系列行為實驗，結果顯示LMDS-1可有效改善因Aβ25-35誘導所導致的短期及長期記憶受損。在病理分析上，我們利用免疫組織化學染色和西方墨點法分析小鼠海馬迴組織，結果顯示LMDS-1可有效改善因Aβ25-35誘導所導致的Aβ堆積、成熟神經細胞缺失、pERK及synaptophysin表現量降低。由病理分析結果推論，LMDS-1可能是經由pY516TrkB活化Ras/MAPK路徑來激活CREB轉錄因子，進而上調mBDNF之表現量，改善因Aβ25-35所導致的記憶缺失。綜合上述結果，LMDS-1是具有治療AD潛力的新型TrkB促效劑，能夠改善動物記憶功能，並緩解AD代表性之病理特徵，希望能為日後AD研究提供一些新的方向與目標。
開發GSK-3β抑制劑作為治療阿茲海默症新藥
(2015) 黃汶函; Huang, Wun-Han
阿茲海默症是目前最常見的一種失智症，為一種不可逆的神經退化性疾病，會造成記憶與行為上的缺失，以及人格的改變，有兩個主要的病徵，分別是類澱粉斑(Amyloid plaques)和神經纖維纏結(Neurofibrillary tangles, 簡稱NFTs)，於罹患阿茲海默症之病人腦部發現。GSK-3β蛋白磷酸化tau蛋白會促使NFTs形成，在阿茲海默症中扮演很重要的角色，因此抑制GSK-3β蛋白之活性會是一個治療阿茲海默症的方式。我們與本校化學系孫英傑老師合作，利用電腦輔助藥物設計及分子間作用力分析技術，開發GSK-3β抑制劑作為治療阿茲海默症新藥。為了獲得足夠的GSK-3β進行抑制劑之篩選，我們構築了含人類GSK-3β基因的質體，並於多株不同的大腸桿菌宿主中表達，然而GSK-3β卻形成了包涵體(Inclusion body)，為此，我們將蛋白表達的條件進一步優化，以及進行蛋白的重折疊(Protein refolding)，期望能獲得可溶的蛋白，然而卻依然無法提升蛋白的溶解度。因此，在本研究中，我們購買了GSK-3β蛋白進行抑制劑之篩選，在電腦模擬篩選出的三十八個藥物中，我們以抑制後蛋白殘餘活性在百分之六十五以下為篩選標準，共篩選出了三個抑制劑，這些抑制劑有潛力能成為治療阿茲海默症之藥物。