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fmr1基因剔除影響斑馬魚社會行為發育與Omega-3多元不飽和脂肪酸之治療效果
(2016) 徐茂庭; Hsu, Mao-Ting
X染色體脆折症(fragile X syndrome, FXS)是最普遍的遺傳性智能障礙症。前人文獻指出FXS在男性及女性的好發比例分別約1/4000及1/8000，而疾病形成原因主要為在表現fmr1基因的啟動子(promoter)上具有過多的CGG重複導致fmr1基因無法正常表現蛋白質(fragile x mental retardation protein, FMRP)與其功能。FXS常見的徵狀包含學習障礙、注意力不集中、過動、焦慮、自閉行為以及社會行為異常等等。而最近斑馬魚由於純熟的基因轉殖技術以及發育學上豐富的研究成果，因此在探討人類疾病中被視為理想的模式動物。而在我們實驗室先前的研究發現fmr1基因剔除斑馬魚會有許多不正常的行為表現，像是過動、不正常的焦慮表現以及恐懼記憶受損。此外，在先前的研究也指出fmr1基因與社會行為的發育有相關。為了探究此議題，我們應用群游行為、群游偏好行為、自發性空間探索行為以及焦慮行為進行相關實驗。此外，我們也利用不飽和脂肪酸的補充來探究其對於在fmr1基因剔除斑馬魚異常行為表現之治療效果。而我們先前研究發現fmr1基因剔除斑馬魚會有群游偏好行為提早發育的現象，並且其現象與焦慮行為有相關，但在此研究中並沒有針對單純同種魚群以及異種魚群的群游進行研究探討。以外，我們繼續探討此群游行為的差異並利用另一種焦慮行為分析方法(novel tank task)探討兩者的相關性。而結果顯示不論在野生型以及fmr1基因剔除斑馬魚，群游行為會在受精後14天形成，並在基因剔除的動物中的群游程度會比正常野生型來得高。此外，研究也發現基因剔除隻斑馬魚在受精後28天會有過動以及焦慮異常的現象，這些結果指出群游行為的差異與過動及焦慮異常有相關。另一方面，我們也想探討ω-3不飽和脂肪酸(n-3 polyunsaturated fatty acids, n-3 PUFAs)對於fmr1基因剔除斑馬魚行為異常之治療效果，因為在其中的二十二碳六烯酸(docosahexaenic acid, DHA)以及二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid, EPA)屬於必需的養分，而文獻指出補充DHA以及EPA可以降低過早死亡的風險以及提升心智能力。此外，在給予ω-3不飽和脂肪酸補充後可降低異常行為的發生，其中包含社會行為異常、自閉以及注意力缺陷。而近期的報告指出在fmr1基因剔除小鼠補充ω-3不飽和脂肪酸可以治療異常的行為，例如：情緒變化、社會互動以及非空間性的記憶能力。在我們的研究中，基因剔除斑馬魚端腦中的grin1b表現量顯著的下降，而htr2a以及htr2cl1兩者表現量顯著的提升。而透過氣相色譜法-質譜法聯用分析全魚的脂肪酸比例，發現基因剔除斑馬魚的不飽和脂肪酸比一般野生型低。此外，我們也發現ω-3不飽和脂肪酸的補充可以治療其行為異常，像是不正常的焦慮表現以及恐懼記憶受損。然而，在肝臟中的ω-3不飽和脂肪酸合成相關酵素的基因表現量沒有顯著的差異。統整以上結果，基因剔除斑馬魚之行為異常可能跟不飽和脂肪酸比例較低有關，以及ω-3不飽和脂肪酸補充對於X染色體脆折症是一種具有潛力的治療方法。
Indomethacin protects rats from neuronal damage induced by traumatic brain injury and suppresses hippocampal IL-1β release through the inhibition of Nogo-A expression
(2012-06-07) Chao, Po-Kuan; Lu, Kwok-Tung; Jhu, Ji-Yi; Wo, Yu-Yuan P; Huang, Tai-Chun; Ro, Long-Sun; Yang, Yi-Ling
Abstract Background Nogo-A is a member of the reticulon family of membrane-associated proteins and plays an important role in axonal remodeling. The present study aimed to investigate alterations in Nogo-A expression following traumatic brain injury (TBI)-induced inflammation and neuronal damage. Methods A weight-drop device was used to deliver a standard traumatic impact to rats. Western blot, RT-PCR and ELISA were used to analyze the expression of Nogo-A and IL-1β. Nogo-A antisense, and an irrelevant control oligonucleotide was intracerebroventricularly infused. We also performed H & E staining and luxol fast blue staining to evaluate the neuronal damage and demyelination resulting from TBI and various treatments. Results Based on RT-PCR and western blot analyses, the expression of Nogo-A was found to be significantly upregulated in the hippocampus beginning eight hours after TBI. In addition, TBI caused an apparent elevation in IL-1β levels and severe neuronal damage and demyelination in the tested animals. All of the TBI-associated molecular and cellular consequences could be effectively reversed by treating the animals with the anti-inflammatory drug indomethacin. More importantly, the TBI-associated stimulation in the levels of both Nogo-A and IL-1β could be effectively inhibited by a specific Nogo-A antisense oligonucleotide. Conclusions Our findings suggest that the suppression of Nogo-A expression appears to be an early response conferred by indomethacin, which then leads to decreases in the levels of IL-1β and TBI-induced neuron damage.
以大鼠模式探討青少年頭部外傷造成其成年行為異常之機轉
(2019) 洪修翊; Hung, Hsiu-Yi
頭部外傷(traumatic brain injury, TBI) 為全世界青壯年人口中，發生率(morbidity)及死亡率(mortality)雙高的意外傷害，患者在創傷後常併發癱瘓(paralysis)、癲癇(epilepsy)、重度憂鬱(major depression)以及焦慮症(anxiety disorder)等一系列後遺症(sequelae)，使得患者在其最具生產力的人生階段，必須接受長期的醫療照護及藥物治療。頭部外傷的病理變化可簡分為初始傷害(primary injury)及繼發性傷害(secondary injury)兩大類。初始傷害發生在受傷當時，而繼發性傷害如:血腫(hematoma)、腦缺血(ischemia)、腦缺氧(hypoxia)及腦水腫(brain edema)，前人研究多專注於成年期的頭部外傷，缺乏青少年期的研究。本研究將利用動物模式，探討青少年期頭部外傷處理後(juvenile TBI treatment, TBI-J)導致成年期情感異常之病理變化及神經機轉。主要採用的行為實驗方法包括強迫游泳實驗(forced swimming test, FST)、糖水偏好實驗(sucrose preference test, SPT)，FST和SPT為測量類憂鬱行為(depression-like behavior)；測量類焦慮行為(anxiety -like behavior)的方法，則包括高架十字迷宮(elevated plus maze, EPM)和恐懼所促進的驚跳反應(fear-potentiated startle, FPS)；而開放空間實驗(open field test, OFT)和平衡桿(rotarod)則用以測量自發性運動(locomotor activity)及運動能力。部分動物被犧牲取腦，並以即時聚合酶連鎖反應分析(real-time PCR, qPCR)或西方墨點法(western blot, WB)分析杏仁核(amygdala)、中央前額葉皮質(medial prefrontal cortex, mPFC)及伏隔核(nucleus accumbens, NAcc)中特定基因之表現，以作為分析憂鬱症的分子生物學依據。同時將會有另一平行組別(parallel group)，用於離體胞外電生理(in vitro extracellular recording)實驗，觀察TBI-J大鼠海馬迴(hippocampus)及杏仁核中，經高頻率電刺激(high-frequency stimulation, HFS)誘發之長期增益效應(long-term potentiation, LTP)之變化。實驗結果顯示，於青少年期(六週齡)曾接受頭部外傷處理的大鼠(TBI-J rats)，於成年後(十週齡)類憂鬱行為明顯增加，在FST實驗中，其不掙扎時間(immobility)明顯較少；在SPT實驗中，糖水之攝取量(sucrose intake) 明顯較低，但其自發性運動和運動功能並沒有明顯改變。此外，在FPS結果顯示，TBI-J組的基礎驚跳反應(basal startle)明顯增加，但促進的驚跳反應百分比(percent potentiated startle)則無顯著變化，合併EPM的數據，推估TBI-J組的類焦慮行為無明顯改變。在手術恢復期投予新興抗藥物7,8-DHF，對TBI-J組成年期類憂鬱行為亦無改善。西方墨點法分析杏仁核表現之磷酸化p42-ERK以及TrKA 明顯下降，而BDNF 則在兩組之中表現無差異。以即時聚合酶連鎖反應分析中央前額葉皮質BDNF的RNA表現量明顯下降，伏隔核中的CRH及Slc6a4有明顯上升的趨勢。最後，電生理結果顯示，杏仁核中HFS-LTP明顯增強，而海馬迴中HFS-LTP無顯著變化。此結果與先前觀察到的基礎驚跳值增加相互契合，顯示TBI-J的處理會影響到杏仁核的功能。本研究之結果顯示青少年期頭部外傷，會增加成年期的類憂鬱行為，而對類焦慮行為則無明顯影響，電生理的實驗結果也與行為實驗結果相符合。但是意外地在機轉上，卻與大多數研究者認定的BDNF表現量減少，引發類憂鬱行為的機制不甚相同，且7,8-DHF的投藥也無法改善TBI-J組的類憂鬱行為，此結果暗示成年期與青少年期頭部外傷引發行為異常之神經機轉可能不盡相同，故在採用相關治療藥物時需做進一步的思考。總結本研究之結果，對於青少年期頭部外傷引發行為異常之機轉進行初步的探討，希望能對相關藥物治療的開發提供所需的方向及基礎。
以小鼠模式探討新生期地塞米松投藥處理的跨代不良影響
(2023) 吳奕昉; Wu, Ying-Fang
地塞米松(dexamethasone, DEX)為一種人工合成的醣皮質素(synthetic glucocorticoid)，一直以來廣泛當作抗發炎藥物使用，同時也用於治療體重過低的早產兒肺部發育不良導致的發炎。然而，許多研究指出新生期地塞米松治療(neonatal dexamethasone treatment, NDT)可能對新生兒的發育與情緒產長期不良影響。腦源性神經滋養因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)，是神經系統中重要蛋白質，對於腦部的發育(development)、神經細胞的分化(differentiation)、及神經細胞的可塑性(plasticity)都扮演至關重要的角色，同時，憂鬱症患者腦中，BDNF的表現量會顯著低於普通人，因此本研究將BDNF與其專一受體TrkB作為憂鬱的生物標記(biomarker)來檢測NDT誘發的類憂鬱行為(depression-like behavior)。本研究採用C57BL / 6J品系小鼠，在出生後第一~三日(postnatal day1~3, PND1~3)給予遞減式劑量 (tapering dosage)地塞米松皮下注射，第一、第二與第三日注射的劑量分別為0.5、0.3與0.1mg/kg。在六周齡時，利用開放空間試驗(open field test, OFT)與高架十字迷宮試驗(elevated plus maze, EPM)來評測小鼠的類焦慮行為(anxiety-like behavior)，另外OFT也可用於測量小鼠的自發性運動功能(spontaneous activity)。此外，也於平行組(parallel group)以懸尾試驗(tail suspension test, TST)與糖水偏好試驗(sucrose preference test, SPT)測試小鼠的類憂鬱行為。於相同周齡時進行即時聚合酶連鎖反應(real-time polymerase chain reaction, qPCR)測量海馬迴中的Bdnf、TRKB與β-actin等基因表現，並利用西點墨法(western blotting, WB)評估BDNF、TrKB與β-actin的蛋白質表現量。並在十一周齡後配對產生子代(F2 SxS 與 F2 DxD)。並測量生育隻數(litter size)、存活率與性別比來測試NDT是否導致生殖毒性。此外，也在F2六周齡時以TST與SPT測試是否出現跨代類憂鬱行為。於同周齡時，以qPCR測量海馬迴中的Bdnf、TRKB等基因表現，並以WB測量BDNF、TrKB的蛋白質表現量。最後，以TST評估交叉撫育(cross-fostering)是否影響跨代類憂鬱行為。實驗結果表明，F1 NDT小鼠成長至青春期時體重顯著降低，代表有效投藥。OFT結果顯示 NDT小鼠自發運動功能未受影響，NDT雄性小鼠在中間區域時間(center area)顯著增加，顯示NDT會減少雄性小鼠的類焦慮行為，對母鼠則沒有影響。EPM結果則顯示NDT不會對公母鼠的類焦慮行為產生影響。TST結果顯示F1 NDT與F2 DxD公鼠的不掙扎時間皆增加，在母鼠方面則沒有差異。另外，在SPT中，F1 NDT與F2 DxD公鼠對於糖水的偏好程度也顯著下降，在母鼠方面則沒有差異。上述結果顯示NDT會導致跨代類憂鬱行為的增加。qPCR與西點墨法結果顯示在F1 NDT雄性小鼠海馬迴中BDNF與TrkB表現量都減少，雌性則未出現顯著差異；F2 DxD雄性小鼠在海馬迴中TrkB表現量顯著減少，雌鼠則無顯著差異。以上結果表明NDT會導致海馬迴中BDNF與TrkB表現量的減少，以及跨代TrkB表現量的減少。NDT在生殖方面的影響，包括F2 DxD的生育隻數與存活率都顯著減少，代表NDT會對子代的生殖造成影響，F2在性別比則沒有影響。最後，在TST中經過交叉撫育(cross parenting)的F2 SxS-Df小鼠相對於控制組(F2 SxS)，不掙扎時間顯著增加；經過交叉撫育的F2 DxD-Sf小鼠相對於控制組(F2 DxD)，不掙扎時間則未出現顯著差異。綜上所述，我們推論NDT誘發的跨代憂鬱可能與NDT造成海馬迴中TrkB表現量有密切聯繫，並且母鼠的照料與遺傳因素皆可能參與NDT造成的跨代憂鬱。
以斑馬魚模式進行腦功能側化相關研究
(2017) 吳曜如; Wu, Yao-Ju
斑馬魚(Denio rerio)因其胚胎透明、容易飼養及觀察等優點，近年成為神經與發育生物學研究之新興動物模式。斑馬魚的神經系統與大多數硬骨魚類似，其端腦 (telencephalon) 的主要構造、相對體積大小、解剖位置及功能與哺乳類之邊緣系統 (limbic system) 相似，為一個易於操作的端腦功能研究模式。本篇論文即利用斑馬魚的各項研究優勢，進行三個部分的研究，以探討斑馬魚端腦的功能、相關之運作過程與訊息傳遞之機轉。在第一章中，我們延續先前的實驗成果，利用吸引法(aspiration)對端腦進行直接的破壞，以探究端腦在空間記憶形成上所扮演的角色，結果顯示端腦的左、右兩半球，分別對於空間及情緒性記憶 (emotional memory) 有著不同的影響，特別是在獲取 (acquisition) 及重新擷取 (retrieval) 的過程中，而對端腦進行單側破壞(unilateral ablation)，均可干擾情緒性記憶的形成。在第二章中，由於過去文獻發現X染色體脆折症 (fragile X syndrome) 患者在腦側化 (cerebral lateralization) 的表現上受到影響，故藉著fmr1基因剔除品系斑馬魚，探討此斑馬魚身上，是否會呈現類似人類病患之異常情緒性行為，結果證實了fmr1之缺損，會造成斑馬魚情緒性行為之發展異常，也會干擾了抑制性逃避記憶 (inhibitory avoidance memory) 的形成。在第三章中，主要使用了電生理的實驗方式，探究斑馬魚端腦外側 (Dl) 到端腦內側 (Dm) 之訊號傳遞。我們發現不只通往同側的端腦內側 (ipsilateral telencephalic Dm region) 有訊號傳遞，而在對側 (contralateral) 端腦之內側亦有類似的訊號傳遞，並且兩側同時存在着代表神經可塑性的長期增强效應long-term potentiation (LTP) 及長期抑制效應long-term depression (LTD) 現象，兩者的作用機制需要麩胺酸NMDA及代謝性受體 (metabotropic glutamate receptor) 的參與；其神經可塑性之LTP與LTD模式，在左、右側端腦中的表現並非完全相同，這呼應了第一階段的實驗結果，進一步證實了斑馬魚的左右側端腦，在處理學習與記憶的功能時，扮演著不同的角色。最後我們也發現，有別於哺乳類動物，斑馬魚主要藉由前連合 (anterior commissure) 構造進行兩側端腦的訊息傳遞。總結上述三階段的研究成果，可證明斑馬魚端腦中亦存在著腦側化的現象，而斑馬魚確實能應用於探討腦側化的機轉研究。
利用腦側化反轉斑馬魚探討端腦的功能
(2021) 李宗祐; Li, Zong-You
腦側化(cerebral lateralization)是指左右邊大腦半球(cerebral hemisphere)各會偏重執行(dominate)某些特定功能，為一種脊椎動物常見的現象。這種功能性的腦側化(functional lateralization)又可追溯至左右腦結構，或是特定分子於左右腦分佈的不對稱性(asymmetric)。許多文獻指出上丘腦(epithalamus)是探討斑馬魚腦部結構的不對稱(structural asymmetry)之重要標的。副松果體位於(parapineal)上丘腦中，正常情況下，該核團約有98%的機率會位於左腦中，僅少部分「腦反轉」個體(brain inversed)其副松果體會位於右腦。本計劃比較一般個體及腦反轉個體間，外顯行為及兩側端腦功能差異，結果將有助於了解斑馬魚腦結構不對稱性對，於腦功能側化的影響。目前已知功能性腦側化會體現於個體的認知(cognition)、情緒(emotion) 和學習與記憶(learning and memory)等面向。本研究利用腦側化反轉斑馬魚，探討整合結構不對稱性對情緒與認知的影響。本研究分別使用野生型(wild-type, WT)及foxd3:GFP品系的基因轉殖(transgenic, TG) 斑馬魚作為實驗對象，該TG品系斑馬魚的副松果體會表現外源性的綠色螢光蛋白(exogenic green fluorescence protein, GFP)，故可藉此判別副松果體位置，以篩選出正常(無反轉)的左側副松果體個體(left-side parapineal, Lpp)及腦反轉的右側副松果體個體(right-side parapineal, Rpp)個體。研究包括了四階段的行為實驗(behavioral experiment)，第一階段是基礎運動能力測試，用以確認各實驗動物的自發性游動(locomotor activity test)是否正常，基礎運動功能正常的個體，方能進入下一階段實驗。第二階段實驗為類焦慮行為(anxiety-like behavior)測試，本研究選用新穎性水箱測試(novel tank test)，交叉比對不同組別實驗動物的類焦慮行為表現。第三階段則為抑制性逃避學習測試(inhibitory avoidance test)，檢核腦反轉對恐懼記憶(fear memory)的建立是否有差異。第四階段則是利用腦反轉的TG斑馬魚，探討隨著腦構造反轉後，其功能性腦側化及偏重執行的外顯行為是否同樣出現反轉的現象。實驗結果顯示，腦反轉個體(Rpp)的運動功能與學習能力未受影響，但類焦慮行為明顯增加。在認知功能方面，對無反轉斑馬魚(Lpp)施以右側端腦破壞，會干擾空間及恐懼學習能力，故推測其與野生型斑馬魚相同，空間及恐懼的學習主要由右側端腦所主導，而腦反轉的斑馬魚(Rpp)則轉變為左側端腦主導。因而可推論斑馬魚的功能性腦側化將隨腦部發育反轉，而發生左右顛倒的情形。我們相信端腦功能性側化確實存在於斑馬魚的學習和記憶過程中，但該現象是來自於先天形生(innated)的神經迴路？或是後天經驗學習後(acquired)才逐步建立？仍有賴進一步探討。本研究也觀察到即使對端腦進行較小面績的破壞，但倘若破壞到較關鍵的部位，仍會對空間和恐懼學習造成顯著的損害。
利用開放原始碼之深度學習軟體評估二甲基亞碸對FMR1突變斑馬魚的治療效果
(2021) 歐艾瑞; Odle, Eric
背景簡介：FMR1 (fragile X mental retardation 1) 基因位於人類的Xq27.3基因座，當其CGG核苷酸重複序列 (nucleotide repeat) 過長時，將會造成X-染色體脆折症 (fragile X syndrome, 簡稱 FXS)。現已開發出可用於研究FXS的斑馬魚 (Danio rerio) 突變品系，相較於囓齒類動物，斑馬魚具有快速發育、幼體透明和高繁殖力等研究優勢。前人的囓齒類動物研究發現，FMR1突變與發炎反應間存有關聯，特別是壓力條件下的細胞激素 (cytokine) 和c-Fos的表現。已知二甲基亞碸 (dimethyl sulfoxide，簡稱DMSO）為一種的消炎藥 (anti-inflammation drug)，具有多種免疫調節效果和臨床應用。本計劃藉由建立清晰的FMR1突變行為和基因表達表型後，來探討DMSO當作治療FXS藥物的可能性。研究方法：利用顯微鏡觀察受精後 (post-fertilization, dpf) 三天大幼魚的心率和體長，以評估DMSO處理對FMR1突變品系胚胎及幼體發育的影響。採用公開性的「深度學習軟件」，進行多動物同時自發性運動跟踪法 (multi-animal locomotor tracking)，分別對幼魚進行2分鐘 (n = 10) 及對成魚進行5分鐘 (n = 5) 的記錄及分析。通過觀察幼蟲的趨態性 (thigmotaxis) 和淺水內聚性 (shoal cohesion) 來評估幼魚的數焦慮行為 (anxiety-like behavior)，並使用新型水箱潛水模式 (novel tank) 對成魚進行焦慮評估。利用C-start反射評估幼魚的學習行為通過觀察幼蟲的趨態性 (thigmotaxis) 和淺水內聚性 (shoal cohesion) 來評估幼魚的焦慮程度，並使用新型水箱潛水模式 (novel tank) 對成魚進行焦慮評估。利用C-start反射評估幼魚的非聯結型學習行為 (non-associative learning)，而成魚則採用抑制性逃避模式 (inhibitory avoidance) 來評估學習反應。並以2項選擇模式 (two choice paradigm) 來評估成魚的社會興趣反應 (social interest paradigm)。最後透過定量聚合酶連鎖反應 (quantitative PCR) 評估全腦中FMR1和細胞激素 (cytokines) 的基因表現。實驗結果：突變品系成魚的行為表型分析顯示，同型合子 (homozygotes) 出現過動的反應 (hyperactivity)，異型合子 (heterozygotes) 對陌生魚的社會興趣 (allospecific social interest) 增加，同型合子中的焦慮反應及恐懼學習(fear learning)減少。DMSO的長期投予最佳濃度為0.05％，可恢復突變品系幼魚的趨態性(thigmotaxis)和淺灘凝聚性 (shoal cohesion) 行為表型。在5-dpf時觀察到誘導的C-起始反射 (strike induced C-start) 的減少，暗示該濃度的DMSO對毛細胞可能具有潛在的毒性，然而在7-dpf的幼魚身上，並未呈現空間運動的異常。該濃度的DMSO投予能夠改善突變品系成魚的焦慮和學習缺陷等行為表型。儘管DMSO處理不能使FMR1的表現恢復到正常水平，但能顯著改善c-Fos及適度改善細胞激素因子 (IL-1β，IL-6和IL-10) 的表現。結論：本計劃的結果顯示，1）FMR1突變品系的同型合子為適合的FXS動物模型，2）DMSO的使用可減少突變品系幼魚的異常行為，3）DMSO可降低突變品系成魚的異常行為，並使其腦中發炎反應基因 (inflammation genes) 表現減少。討論：突變品系成魚的運動，焦慮和恐懼學習結果與以前的囓齒動物和斑馬魚FXS模型大致相同。但在社會興趣的結果有差異，前人報導將突變品系對同種 (cospecific) 的興趣大於同種異體 (allospecific)。在幼魚實驗中的一些新發現，包括FMR1突變體在5-dpf時明顯的非聯結型學習 (non-associative learning) 障礙，焦慮以及淺灘凝聚力的增加。過去的文獻推測的腦部發炎反應基因增加，本計劃發現FMR1 KO樣本腦中神經炎症基因被下調。進一步探討特次腦區的特異性表現 (region-specific expression)，特別是在端腦內側和外側大腦皮層 (telencephalic medial and lateral pallium) ，可能會得到與囓齒類動物一致的結果。
利用離體電生理模式探討斑馬魚端腦雙側之功能性連結及突觸可塑性
(2016) 陳郁嵐; Chen, Yu-Lan
腦側化(cerebral lateralization)為一種脊椎動物常見的現象，意指大腦兩側半球各自對不同的功能扮演較優勢的角色(dominant)；腦側化對於生物個體的行為表徵扮演著重要的角色，例如人類的左右腦各負責不同類型的工作；又或是魚類會利用兩眼視覺系統，區別熟悉與陌生的環境。硬骨魚的端腦(telencephalon)被認為與學習和記憶的形成有關，特別是端腦的背外側區(dorsal lateral, Dl)及背中側區(dorsal medial, Dm)最為相關，前人利用螢光染劑DiI注射於Dl腦區後，可在Dm腦區偵測到螢光訊號，證明了Dl和Dm腦區間存在神經投射的連結。近年來，斑馬魚已成為探討學習與記憶、藥物成癮以及焦慮等行為非常重要的模式物種。從斑馬魚的胚胎發育研究以及行為觀察，已有充分的證據顯示斑馬魚腦部和哺乳類一樣，具有腦側化的現象，但關於斑馬魚端腦腦側化的研究卻非常缺乏。因此，本實驗目的為利用電生理技術探討傳遞到同側(ipsilateral)以及對側(contralateral)的Dl-Dm投射路徑的神經傳遞與突觸可塑性(synaptic plasticity)現象的異同。首先，實驗測得在單側的Dl給予電刺激，能夠在同側以及對側的Dm引發一個負電位的電場電位(negative field potential)，還可利用高頻電刺激(high frequency stimulation, HFS) 及低頻電刺激(low frequency stimulation, LFS)，分別誘發出長期增益效應(long-term potentiation, LTP)以及長期抑制效應(long-term depression, LTD) ，這兩項均為探討神經突觸可塑性的重要性指標。實驗中利用連續五次的HFS (每秒100 Hz)來誘發LTP，結果顯示在同側及對側的Dm腦區所誘發的LTP現象，此外，如預先投予NMDA受器的拮抗劑D-AP5 (30 μM)10分鐘後才進行誘發，可完全阻斷對側LTP的產生。但將D-AP5藉由灌流廓清後，則又可重新利用HFS誘發出LTP。由此證實了HFS所誘發的對側LTP，需依賴NMDA受器的活化。將左右兩側誘發的LTP實驗結果，經交叉比對分析後發現，從左側及右側的Dl給予HFS，所誘發出的同側LTP會有所差異，從右側誘發出的LTP強度會比左側誘發的小，而單從右側Dl誘發的LTP而言，其訊號強度同側會較對側的小。本實驗接着以LFS (每秒1 Hz)持續刺激20分鐘，或是投予代謝型谷氨酸受體興奮劑DHPG (40 μM) 10分鐘來誘發LTD，兩者都能誘發出至少維持一小時的LTD現象。而我們將以代謝型谷氨酸受體興奮劑DHPG所誘發的同側及對側結果比較後，我們發現對側的抑制效果較同側好。另外，Dm腦區所誘發的電場電位可以分成突觸的(synaptic, P1)以及非突觸的(non-synaptic, N2)組成，而對側Dm腦區的P1時間較同側Dm腦區的時間長，可能造成的原因為對側端腦的紀錄點較同側端腦紀錄點的距離更遠，因此有對側P1時間較同側長的現象。另外，藉由即時聚合酶鏈鎖反應(Real-time polymerase chain reaction, Real-time PCR)技術，我們發現NMDAR1a受器的mRNA在左側端腦的表現上高於右側端腦的趨勢。綜合而言，本研究的重要發現為首次觀察到斑馬魚端腦的Dl腦區和Dm腦區之間，存在著同側以及對側神經連結的突觸可塑性現象，並運用了電生理模式證明了斑馬魚端腦具有腦側化的現象。本研究成果將有助於日後為利用基因轉殖斑馬魚探討端腦腦側化分子機轉奠定基礎。
探討新生期dexamethasone處理對大鼠海馬迴中動情素受體之表現量及長期增益效應之影響
(2021) 仉鵬愷; Chang, Peng-Kai
地塞米松（dexamethasone, DEX）是一種人工合成的糖皮質固醇（synthetic glucocorticoids），數十年來被廣泛用作抗發炎藥物（anti-inflammatory drugs）。同時也用來治療及預防出生體重過低（extreme low birth weight, ELBW）早產兒的慢性肺部疾病（chronic respiratory disease）。許多研究指出，新生兒時期的地塞米松治療（neonatal dexamethasone treatment, NDT）可能對早產兒的情緒（emotional）和認知（cognitive）功能產生長期不良的作用。我們先前的研究指出NDT於雄鼠與雌鼠身上，均會造成長期的不良影響，包含類憂鬱行為（depression-like behavior）的增加，以及雌性大鼠海馬迴（hippocampus）中α型雌激素受體（estrogen receptor alpha, ERα）和G蛋白雌激素受體（G-protein coupled estrogen receptor, GPER so-called GPR30）的表現量下降，且可能為NDT對雌鼠造成長期不良影響的重要原因。我們本研究中驗證是哪一種雌激素受體，為造成NDT青少年雌鼠長期不良反應的主因。本實驗中使用新生的Wistar大鼠，從出生後第一天到第三天（postnatal day 1~3, PND 1-3），給予劑量遞減式（tapering）的DEX皮下注射，自PND 1-3其劑量依序為0.5、0.3和0.1 mg/kg。於六周齡時，利用開放空間試驗（open field test, OFT）評估NDT大鼠自發性運動功能（spontaneous activity），另外透過強迫游泳試驗（forced swimming test, FST），評測NDT大鼠的類憂鬱行為。此外，準備平行組（parallel group）的NDT大鼠，於相同周齡時進行即時聚合酶鏈鎖反應（real-time polymerase chain reaction, qPCR）評估海馬迴中Erα, Erβ, Gper, Grin1, Grin2a, Grin2b等基因表現。並利用西方墨點法（western blotting）評估mitogen activated protein kinase （MAPK）的蛋白質表現量及其磷酸化水平（phosphorylation level）。亦進行了離體胞外電生理記錄（in vitro extracellular recording），測量海馬迴以高頻刺激誘導的長期增益作用（high frequency stimulation-induced long-term potentiation, HFS-LTP），以評估其海馬迴的神經可塑性（neuroplasticity）。最後利用強迫游泳試驗，以評估投予ERα致效劑（agonist），是否對NDT大鼠具有抗憂鬱（anti-depressant）的功能。實驗結果顯示，NDT動物青春期前的體重顯著降低，這證明DEX的有效投藥。 OFT的結果顯示NDT動物的自發運動功能未受影響。FST的結果顯示NDT會導致類憂鬱行為的增加。雌性青少年大鼠NDT組的不掙扎的時間（immobility）與對照組相比有顯著增加。而雄性青少年NDT大鼠，則必須先給予高台曝露（platform exposure）之急性壓力處理後，其不掙扎的時間才有顯著增加。qPCR結果顯示，雌性青少年NDT大鼠海馬迴中Erα的表現顯著降低，而Erβ 和 Gper表現量則無明顯差異。NDT雄性青少年大鼠海馬迴中Erα, Erβ 及 Gper的表現量，與控制組間相較，皆無呈現顯著差異。雌性青少年NDT大鼠海馬迴中Grin1, Grin2a 及 Grin2b表現量皆沒有呈現差異。電生理實驗結果顯示NDT母鼠的海馬迴HFS-LTP有顯著下降的現象，而輸入和輸出曲線比值（input/output curve ratio, I/O curve）結果顯示，NDT老鼠與對照組相比有顯著下降的現象。而在配對脈衝促進 (pair-pulse facilitation, PPF) 實驗結果中並無呈現顯著差異。透過表面灌流 (suprafusion) ERα致效劑丙吡唑三醇（propyl pyrazole triol, PPT）後，NDT雌性大鼠的海馬迴HFS-LTP恢復至正常範圍。而預先投予ERα的拮抗劑methyl-piperidino-pyrazole （MPP），可以阻擋PPT對HFS-LTP的恢復效果；而NDT組經皮下注射PPT後，其不掙扎的時間明顯減少，與對照組相比無顯著差異，顯示其具有降低類憂鬱行為的效果。最後我們利用GPER的致效劑同時為ERα和ERβ的抑制劑氟維司群（fulvestrant）進行驗證，投予fulvestrant無法使NDT雌性大鼠的海馬迴HFS-LTP恢復至正常範圍。西方墨點法結果顯示，NDT並未影響雌性青少年大鼠海馬迴中MAPK 的蛋白質表現量及磷酸化水平。綜合上述實驗結果，我們推論NDT青少年雌性大鼠的不良反應，較可能是藉由影響ERα的表現而造成。實驗結果可供後續臨床研究參考，例如投予PPT治療NDT所造成的長期不良反應。
探討新生期地塞米松投藥處理對於海馬迴內 BDNF-mTOR 訊息傳遞路徑的長期不良影響
(2023) 吳宗訓; Wu, Zong-Syun
重鬱症 (major depression disorder) 為高盛行率的精神疾病，抗抑鬱藥 (antidepressants) 雖已被廣泛使用於控制及防止重鬱症的惡化，但此類藥物仍存在諸如：從開始服藥至症狀改善之間耗時甚鉅或強烈不良副作用等缺點，因此現存抗抑鬱藥於臨床應用上對於實際改善病患症狀的效果仍十分有限。綜合上述，故現今對於開發新型抗抑鬱藥物的需求是刻不容緩。目前已知早期壓力曝露 (early life stress exposure) 與不良創傷經驗 (adverse traumatic experience) 均為誘發重鬱症的重要風險因子，本研究使用新生期地塞米松投藥處理 (neonatal dexamethasone treatment, NDT) 來模擬早年壓力曝露並成功於小鼠中建立類憂鬱行為模式，並以此模式來探討腦源性神經滋養因子 (brain-derived neurotrophic factor, BDNF)、哺乳動物雷帕黴素靶蛋白 (mammalian target of rapamycin, mTOR) 訊息傳遞路徑與神經發炎反應 (neuroinflammation)、神經可塑性異常 (abnormality on the neuroplasticity) 等如何參與調控NDT所誘發之不良影響。海馬迴 (hippocampus) 為對壓力曝露十分敏感的腦區之一，並與重鬱症的發病機轉高度相關，本研究將著重於探討NDT對於背側海馬迴 (dorsal hippocampus) 內BDNF-mTOR訊息傳遞路徑所造成之影響。於此研究中，實驗動物將於出生後之初三日，逐日接受遞減劑量 (0.5、0.3、0.1 mg/kg) 之地塞米松 (dexamethasone) 皮下注射，並持續飼養直至六週齡時犧牲，並以即時定量聚合酶連鎖反應 (real-time quantitative polymerase chain reaction, qPCR) 分析相關訊息傳遞分子與目標基因的表現量變異，再以胞外電生理技術 (extracellular recording) 紀錄神經訊號傳遞情形。實驗結果顯示，經NDT處理後實驗動物產生長期之不良影響。首先，NDT組之老鼠體重自出生後7至42日與SAL組相比均明顯較輕。NDT組背側海馬迴內之BDNF、TrkB基因表現量下降，顯示其BDNF訊息傳遞路徑受到影響。胞外電生理紀錄發現，NDT組老鼠其海馬迴突觸前、突觸後傳遞與長期增益效應均顯著劣於SAL組動物，上述結果顯示NDT處理將導致動物海馬迴之神經可塑性異常。此外，Nr3C1與Sgk1的表現量上升與Fkbp5的表現量下降顯示其HPA反應軸失調。ELISA結果顯示NDT組之動物血清內相較SAL組具有較高之糖皮質素表現量，然而此差異並未達統計檢定顯著水準。隨後，經檢驗背側海馬迴組織內相關突觸上離子通道表現量，其結果顯示：於NDT組別中Grin2a、Grin2b、Gria1、Cacna1c與Cacna1e表現量下降；然而，Slc1a6、Slc12a5、Gabra3、Gabra4、Gabbr1及Gabrd表現量顯著上升。近一步檢驗突觸蛋白 (synaptic protein) 與細胞骨架相關基因顯示Syn1、Syn2、Arc、Dlg4、Sptbn2與Khdrbs表現量顯著下降。為近一步了解上述變異之上下游訊息傳遞路徑，實驗結果顯示Raptor、Rictor與Ctnnb1基因表現量於NDT 組中顯著下降。除此之外，於NDT組中轉錄因子Nfkb1 基因表現量顯著增加，而Creb1基因表現量顯著下降，但發炎因子Il6與模式識別受體 (pattern recognition receptor, PRR) Nlrp6卻於NDT組中顯著下降。最後，經由連續兩天給予MHY1485，NDT組於懸尾試驗中之不動時間百分比顯著下降，於開放空間試驗中並未發現明顯之行為異常，雖於投藥過程中動物之體重產生些微下降，惟其可於投藥完成後兩天內回覆至基礎水平。綜合上述，實驗結果顯示mTOR訊息傳遞路徑於NDT所誘發之長期不良影響中扮演關鍵角色。據我等所能了解，本實驗為首次利用MHY1485作為抗憂鬱藥進行壓力所誘發之動物類憂鬱行為進行治療，其優良之抗憂鬱效果可作為未來開發新穎抗抑鬱藥物之參考。
探討綑綁處理對於青少年期與成年期條件化恐懼與焦慮行為之影響
(2019) 林維星; Lin, Wei-Hsing
在青少年或成年期遭受壓力（stress）或創傷經驗（traumatic experience），例如心理或生理的虐待（physiological or psychological abuse），均會造成長期的不良影響（long-term adverse impact），包括引發創傷後壓力症候群（post-traumatic stress disorder, PTSD），及提高罹患焦慮症（anxiety）之風險，但是目前對於探討青少年壓力或創傷長期影響的動物模式十分稀少。而在青少年期時，下視丘-腦垂體-腎上腺軸（hypothalamic-pituitary-adrenal axis, HPA axis）仍處於發育及調整期，因此遭受創傷時，會較成年期有更嚴重的不良影響。本研究之主要目的為探討青少年的壓力及創傷經驗，造成長期不良影響之機轉。實驗結果顯示，於小鼠青少年期（五週齡）給予每天兩小時連續兩天綑綁處理（immobilization treatment, IMO），會在隔週的條件化恐懼實驗中，造成恐懼記憶無法削減（extinction）的現象。而只進行單一次的IMO處理，則不會對削減作用有明顯影響，表示可能有累加效應（accumulation effect）的存在。之後在開放空間測試（open field test），IMO 組亦出現類焦慮行為（anxiety-like syndrome）增加的現象。另外在即時定量聚合酶連鎖反應（real-time polymerase chain reaction, qPCR）中，發現經兩次IMO處理的動物，其海馬迴（hippocampus）中Fkbp5的表現量顯著增加。爾後透過離體胞外電生理記錄法（in vitro extracellular recording）測試海馬迴的長期增益效應（long-term potentiation，LTP），結果顯示青少年經IMO處理兩次的動物，在其海馬迴的LTP出現增強的現象。此外，我們發現青少年IMO 處理組（五週齡，IMO_2 (J)）與成年IMO處理組（十一週齡，IMO_2 (A)）皆在十二週齡的條件化恐懼實驗中呈現無法削減恐懼記憶的異常反應，牠們也在高架十字迷宮（elevated plus-maze）中出現類焦慮的行為特徵。透過qPCR發現Fkbp5的表現量，只在IMO_2 (A) 的海馬迴與杏仁核（amygdala）中都明顯增加；另外在Bdnf 的表現量，只在IMO_2 (A) 組動物的杏仁核中明顯增加，而在IMO_2 (J)組皆沒有顯著增加，顯示青少年IMO處理對Fkbp5與Bdnf的表現量只有短期影響，效果不會持續到成年期。本實驗採用青少年或成年期綑綁方式，模擬創傷經驗對於不同時期條件化恐懼及類焦慮反應之影響，發現青少年的IMO 處理可能有累加效應（accumulation effect）與急性影響（acute effect），而本研究提供往後可供研究青少年期壓力或創傷經驗的動物模式。研究成果具有臨床應用之價值，將有助於未來新一代治療策略及藥物之開發。
探討青少年期捆綁處理對海馬迴功能之長期不良影響
(2020) 董佑萱; Tung, Yu-Hsuen
青春期遭遇性騷擾(sexual harassment)、學校霸凌(bullying)、情感虐待(psychological abuse)和家庭暴力(domestic violence)等創傷經驗會導致心理創傷(psychological trauma)，已被證實會對心理健康產生長期的不良影響，並增加成年後罹患精神疾病的風險。不幸的是，針對其不良影響的發生，目前僅有少數研究與有限的治療策略。本研究之主要目的為利用青春期綑綁處理動物模式(juvenile immobilization treatment, J_IMO)模擬青少年期創傷經驗，以探究其對海馬迥功能(hippocampal function)的不良影響及其神經機。本研究採用C57BL / 6J品系雄性小鼠，在出生後第35天和第36天(postnatal day, PND)時進行每天一次2小時，共兩天的J_IMO處理。於第二次綑綁處理後一週時(PND-42)分別進行行為(behavioral)、電生理(electrophysiological)和生化(biochemical)實驗。行為實驗採用抑制迴避測試(inhibitory avoidance, IA) 來評估海馬迴(hippocampus)的學習記憶功能，IA為一與海馬迥功能高度相關的記憶試驗。我們也利用開放空間測試(open field test, OFT)和高架十字迷宮測試(elevated plus-maze test , EPM)來評估J_IMO的類焦慮行為(anxiety-like behavior)。部分動物則斷頭犧牲取腦，製成海馬迴腦切片用於離體胞外電生理記錄(in vitro extracellular recording)，以高頻電刺激(high-frequency stimulation, HFS)誘發的長期增益效應(long-term potentiation, LTP)，來評估動物海馬迴的神經可塑性(neuroplasticity)。為了防止行為實驗對生化分析所造成之干擾，我們以相同的方式準備了另外一批動物，於PND-42時斷頭犧牲，取出其海馬迴進行即時定量聚合酶連鎖反應(real-time polymerase chain reaction, qPCR)分析Grin2a （NR2A受體），Slc12a2 （鈉鉀氯共轉運蛋白2，又簡稱NKCC1），Slc12a5 (鈉鉀氯共轉運蛋白5，又簡稱KCC2), Gabra1（GABAA受體）和Fkbp5（co-chaperone with the heat shock protein 90 and steroid complex）等基因的表現，並且利用西方墨點法（Western blot）來確認NKCC1的蛋白質表現量。實驗結果顯示，經 J_IMO處理的小鼠，其抑制性迴避學習增強，合併出現削減學習(extinction learning)減弱的現象。而OFT的結果顯示J_IMO組的類焦慮行為有增加的情形，然而在EPM中並未獲得一致的結果。J_IMO組動物的海馬迴HFS-LTP有增強的現象，與對照組相較經J_IMO處理小鼠的輸入和輸出曲線比值（input/output curve ratio, I/O curve）中出現顯著增加的現象。而在配對脈衝促進（pair-pulse facilitation. PPF）的結果並無顯著差異。這些結果暗示海馬迴HFS-LTP的增強應是源自突觸後的機制(post-synaptic mechanism)，例如受體表現量增加(up-regulation)，或者信號傳遞活性增強。qPCR的結果顯示，經J_IMO處理小鼠海馬迴中Grin2a和Slc12a2的表現量顯著增加，可以證明J_IMO組海馬迴突觸後的機制改變。Fkbp5，Slc12a5和Gabra1的表現量未呈顯著差異。之後，我們以表面灌流(suprafusion)方式投予兩種環形利尿劑(loop diuretics)，呋塞米(furosemide)或布美他尼(bumetanide)為NKCC1抑制劑，可將海馬迴HSF-LTP恢復至正常範圍。綜合各項實驗結果，經過J_IMO處理的小鼠表現出異常的行為表現，包括迴避學習之增強、消減學習(extinction learning)能力減弱，和類焦慮行為的增加。J_IMO組的海馬迴HSF-LTP增強海，馬迴功能相關基因如Grin2a，Slc12a2的表現量明顯改變。這些結果共同顯示出，給予J_IMO急性處理也可能對海馬迴功能產生長期影響。本研究結論為J_IMO處理成功地模擬了青少年的創傷經歷，並且產生長期的不良影響，這和前人之成年IMO處理的研究發現是一致的。有趣的是，我們發現NKCC1在J_IMO小鼠中的海馬迴表現量發生了變化，這解釋J_IMO治療處理不良反應的可能機制。我們建議NKCC1抑制劑如布美他尼可以作為治療藥物，以減輕青少年創傷事件引起的行為異常。
新生期投予地塞米松對於成年雌性大鼠海馬迴 G 蛋白偶合雌激素受體之影響
(2019) 羅子雅; Lo, Tsz-Nga
地塞米松（dexamethasone, DEX）是一種合成的糖皮質激素，通常用作消炎藥物。它亦被廣泛用於早產兒身上（prematurely born infant），以治療早產嬰兒的慢性肺部疾病（chronic lung disease)。新生期投予地塞米松治療（neonatal dexamethasone treatment, NDT）已被廣泛研究並證明對中樞神經系統具有長期的不良反應。我們先前的研究結果顯示，新生期投予地塞米松治療（neonatal dexamethasone treatment, NDT）對於成年雄性和青春期雌性大鼠均引起類憂鬱行為（depression-like behavior）的顯著增加。然而，新生期投予地塞米松治療，對成年雌性大鼠的長期影響仍有待探討。除了傳統的alpha （ER）和beta（ER）型雌激素受體外，G蛋白偶合雌激素受體（G protein-coupled estrogen receptor, GPER舊稱為GPR30）亦廣泛分佈於生殖系統、心血管系統和腦組織中，尤其是在海馬迴（hippocampus）中有大量表現。前人的研究發現GPER是一種位於細胞膜上的雌激素受體，在乳腺、血管內皮細胞及生殖系統相關癌症中呈現異常的表現及作用。然而，對於GPER的神經作用，特別是對行為的影響及作用機制仍待探究。GPER是否會影響海馬迴長期增益效應（long-term potentiation, LTP）的形成？以及杏仁核（amygdala）是否會受到NDT影響？還有待進一步研究。本研究之主旨在為探討GPER是否參與NDT對雌性大鼠產生的長期不良影響。在此研究中，出生第1天至第3天（postnatal day 1 to 3）對雌性幼鼠以皮下注射方式（subcutaneous injection）投予遞減劑量（0.5, 0.3,& 0.1 mg/kg）的DEX。爾後於10週齡時進行一系列的行為、生化以及電生理實驗。例如以強迫游泳實驗（forced swim test, FST）和蔗糖糖水偏好實驗（sucrose preference test, SPT）來評估NDT所誘發的類憂鬱行為。此外使用開放空間測試（open field test, OFT）來評估DEX的非專一效應 (non-specific effect)。為了防止行為實驗對生化分析所造成之干擾，我們以相同的方式準備了另外一批動物，於十週齡時斷頭犧牲，取出其海馬迴進行即時定量聚合酶連鎖反應（real-time polymerase chain reaction, qPCR）分析ERα、ERβ和GPER的表現。部分動物則用於離體胞外電生理記錄實驗 (in vitro extracellular recording)，以檢測海馬迴腦切片中，由高頻電刺激（high-frequency stimulation, HFS）所誘發的長期增益效應（long-term potentiation, LTP），並以直接灌流方式（suprafusion）投予GPER的選擇性致效劑（selective agonist） G1，評估G1是否能挽回海馬迴中的LTP。再以直接灌流方式（suprafusion）投予GPER的選擇性拮抗劑（selective antagonist） G15，評估G15是否能阻斷G1所挽回海馬迴中的LTP。實驗結果顯示，NDT雌鼠在FST中的不動的時間百分比(percent time of immobilization) 明顯增加，而SPT的結果亦顯示其蔗糖偏好指數(sucrose preference index)明顯降低，但NDT與控制組在OPT中的水平運動距離(total horizontal moving distance)並無明顯差異，此項結果顯示NDT成年雌性大鼠的類憂鬱行為增加，應與DEX的非專一效應對活動能力之干擾無關。在qPCR的結果顯示，青少年期時雌性NDT大鼠海馬迴中ER、ER和GPER的表現量，與控制組相比並無明顯差異。然而，在成年期NDT雌性大鼠的海馬迴中GPER的表現量則明顯減少。離體胞外電生理記錄的結果顯示，成年期NDT雌性大鼠海馬迴中，HFS-LTP的強度顯著降低，而在表面灌流GPER的選擇性致效劑G1後，NDT雌鼠海馬迴之LTP可恢復至正常水平，並且在表面灌流GPER的選擇性拮抗劑G15後G1的拯救效果被完全阻斷。總結各項實驗結果，GPER在NDT對海馬迴中LTP之異常表現中，扮演了十分重要的角色。後續的研究可針對G1是否亦能對NDT所引發的行為異常，具有治療效果進行進一步的探討。利用藥第投予恢復海馬迴中GPER的表現量，或是利用GPER的選擇性致效劑，極可能對NDT所造成之行為異常，具有治療的效果，未來可朝此二個方向進行藥物研發。關鍵詞: 地塞米松、海馬迴、G 蛋白偶合雌激素受體、長期增益效應
新生期投與dexamethasone對母鼠的長期不良影響
(2018) 邱惠芳; Chiu, Hui-Fang
地塞米松 (dexamethasone, DEX) 是一種人工合成的醣皮質激素(synthetic glucocorticoid)，目前廣泛做為消炎藥劑(anti-inflammatory)，並用於治療早產兒之呼吸窘迫症 (respiratory distress syndrome)，但多年來研究發現新生期投與DEX (neonatal DEX treatment; NDT) 會導致腦部發育與認知功能的不良影響。海馬迴 (hippocampus) 是空間記憶 (spatial memory) 和連結性學習記憶(associative learning and memory) 的主要腦區，而杏仁核 (amygdala)則是調控情緒的重要腦區，兩者均屬於邊緣系統 (limbic system) 的成員，其功能異常與精神疾病如憂鬱症 (major depression) 及焦慮症 (anxiety disorder) 有重要關聯。前人研究顯示NDT會導致大鼠的類憂鬱行為 (depression-like behavior) 明顯增加，過去關於NDT的研究多著重於公鼠，較少著墨於母鼠，本研究利用新生期母鼠，模擬臨床上早產兒的投藥方式，以濃度遞減式 (tapering dosage) 於出生後第1~3天 (postnatal day-1 to 3) 連續3天依序投予DEX (0.5 mg/kg, 0.3 mg/kg 和 0.1 mg/kg)，並利用細胞外電刺激紀錄 (in vitro extracellular recording)、西方墨點法 (western blot analysis)、抑制逃避學習實驗 (inhibitory avoidance task; IA) 與強迫游泳行為實驗 (forced swimming tests; FST)，評估NDT對青春期 (6週齡) 與成年期 (10週齡) 的母鼠海馬迴與杏仁核之功能影響。實驗結果發現在海馬迴和杏仁核，利用高頻電刺激 (high-frequency stimulation; HFS) 誘發的長期增益現象 (long term potentiation; LTP) 中，青春期NDT母鼠的LTP有抑制的情形，而在成年期母鼠的海馬迴和杏仁核以HFS誘發的LTP則有減弱的情形。西方墨點法的結果顯示青春期與成年期母鼠海馬迴與杏仁核的estrogen receptor alpha (ER) 表現量均低於控制組，而estrogen receptor beta (ER) 的表現量與控制組無顯著差異。在檢測海馬迴空間記憶功能的IA行為實驗發現，NDT阻斷了青春期NDT母鼠抑制逃避學習，青春期NDT母鼠滯留潛伏 (retention latencies) 時間低於控制組並有顯著差異，但這種阻斷效果不會持續到成年期。評估杏仁核功能的FST行為實驗發現，青春期與成年期母鼠在FST模式中，不游動時間百分比 (percent time of immobility) 明顯高於控制組，表現出類憂鬱行為的反應增加。為避免NDT所引起的可能的毒性效果 (toxic effect) 對行為實驗數據判讀的干擾，故合併測量其自發性活動行為 (locomotor activity)，結果顯示NDT母鼠在青春期和成年期的總水平移動距離 (total horizontal distance movement) 與控制組相比，並無顯著差異。在青春期和成年期母鼠在細胞外電生理紀錄時投予雌二醇 (estradiol) 可部分恢復杏仁核的HFS誘發之LTP；青春期動物於6週齡時連續四天皮下注射雌二醇 (0.25 mg/kg/day)，成年期動物於10週齡時連續四天皮下注射雌二醇，分別在第四天給藥結束30分鐘後立即進行FST行為實驗，結果發現給予雌二醇的NDT母鼠，其類憂鬱行為降低。青春期母鼠在細胞外電生理紀錄給予雌二醇可部分恢復海馬迴的LTP。在染色質免疫沉澱實驗 (chromatin immunoprecipitation assay; ChIP) 中發現幼年期NDT母鼠 (2週齡) 的海馬迴中H3K9乙醯化 (acetylation) 與控制組相比，NDT母鼠的H3K9乙醯化百分比顯著低於控制組。在NDT組於出生後第一天同時投與histone deacetylases (HDAC) 抑制劑trichostatin A (TSA)，可使幼年期母鼠海馬迴ER的表現量恢復至與控制組相近，並可使青春期母鼠海馬迴以HFS誘發的LTP恢復，與控制組相比無顯著差異，以及在IA行為實驗發現海馬迴空間性記憶功能恢復，與控制組相比無顯著差異。總結本篇實驗結果，NDT母鼠在青春期與成年期的海馬迴與杏仁核之LTP、ER表現量、空間記憶及情緒功能均產生不良的影響，然而這樣不利的影響會一直持續到成年期，並且這樣的影響可能與H3K9乙醯化下降有關，而於幼年期投予HDAC抑制劑，或於青春期與成年期給予雌二醇，則可有效地降低NDT的長期不良影響。根據本論文的結果發現，NDT對母鼠產生的長期不良影響並直至成年期，這樣的結果可提供給日後相關研究及臨床投藥做為參考。
漸進式運動計畫與維生素D對中老年女性身心健康成效之研究
(2016) 吳一德; Wu, I-Te
摘要目的：老年女性的健康問題非單一因素造成，藉由持續且規律性的運動訓練，以促進老年女性的身心健康，可提供整體性健康照護，提昇其生活品質。方法：召募75位60歲以上無運動習慣中老年女性，隨機分成5組（每組15人）：阻力訓練＋維生素D組(RT+D)；阻力訓練組(RT)；有氧訓練組(AT)；補充維生素D組(D)及對照組(CON)。實驗組接受12週運動訓練課程（有氧訓練、阻力訓練及補充維生素D (800 IU/day)），每週3 次、每次30分鐘，並達到自覺量表5-6 中等強度等級以上；對照組則正常作息。各組分別於運動訓練介入前、12週運動訓練介入後及停止訓練後1週共3次，檢測功能性體適能(手臂彎舉、坐姿起立、抓背測驗、椅子坐姿前彎、8 英尺立走及2 分鐘原地踏步)、血液生理指標(血壓、空腹血糖、糖化血色素生化值（HbA1c）) 及認知行為(SPMSQ、PSQI、TDQ)問卷。結果：12 週運動訓練介入後，BMI、腰臀圍比、功能性體適能、認知能力、血液生理指標等各項指標皆在運動訓練RT＋D組、RT組及AT組之促進效益顯著優於D組與C組；且停止訓練後1週運動訓練，各項指標仍具有保留訓練的效果。功能性體適能、血液生理指標與認知能力間之相關，分別於功能性體適能各變項間（r =-.441~.568, p<.05）、血液生理指標間（r =-.438~.378, p<.05）、認知能力間（r =-.421~.335, p<.05）、BMI（r =-.438~.268, p<.05）及腰臀圍比（r =-.325~.317, p<.05）間達顯著的相關。顯示，功能性體適能、血液生理指標與認知能力間有某程度上的關聯性。結論：12週的中強度阻力運動訓練與維生素D的組合性介入，較能顯著提升老年女性功能性體適能、認知能力、血液生理指標及日常生活的參與。停止訓練後一個月仍能保留其訓練效益，且運動型態與各變項之促進效益有某程度上的關聯性。因此，阻力健身運動不僅有效增進老年女性在生理與心理機能的優勢效應，更可作為老年女性健身運動處方建立的依據。
缺氧誘導因子1α在頭部外傷後調節神經新生所扮演之角色
(2019) 黃泰淳; Huang, Tai-Chun
頭部外傷 (traumatic brain injury, TBI) 是全世界青壯年人口中¬，盛行率和死亡率雙高的意外事故之一。因頭部外傷主要發生在最具有生產力階段的青壯年人口，在頭部外傷病患中約有25% 會造成終身性殘疾並須長期性的照護，因而造成社會或經濟的損失。因此，相關致病機轉和醫療策略的研發極具重要性。我們先前的研究已經證明血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）調節TBI所引發之神經新生的現象(TBI-induced neurogenesis)是經由活化第二型的VEGF受體 (VEGFR2) 和活化絲裂原活化蛋白激酶 (mitogen activated proteinkinase, MAPK) 訊息傳導路徑。前人研究指出缺氧誘導因子（hypoxia inducible factor, HIFs）在正常狀態細胞中含量較為稀少，但在病理狀態下，如缺血(ischemia) 或缺氧 (hypoxia) 時表現會被誘導大量增加。細胞中的HIFs扮演轉錄因子的角色，會進而誘導多種類型的下游基因之表現，特別是與負責血管增生(angiogenesis)、厭氧反應 (anaerobic)、血管舒張 (vasodilation)、紅血球細胞生成(erythropoiesis)、神經新生 (neurogenesis)。本研究的主要目的為探討HIF-1α在TBI誘導海馬迴內神經新生的角色。第一部份的研究結果發現TBI誘導後可以引起VEGF表現和海馬迴內的神經新生。此外，給予HIF-1α的反義股 (antisense) 或專一的抑制劑2ME2 (2-methoxyestradiol)成功地阻斷了TBI誘導海馬迴神經新生。TBI的誘導下，與HIF-1α降解有關兩個主要酵素中的脯胺醯基羥化酶 (prolyl hydroxylase, PHD)的表現減少，而低氧誘導因子-1 抑制因子 (factor-inhibiting HIF, FIH) 的表現則無改變，我們推測PHD的減少是促使TBI後海馬迴內的HIF-1α蛋白量增加的主要原因。此外，我們也排除了其他HIF亞型，如HIF-2α和HIF-3α參與此機制的可能性。後續實驗中也證明了HIF-1α可以結合VEGF的啟動子以調控其表現。總結第一部分的實驗結果，我們證明是HIF-1α而非HIF-2α和HIF-3α為激活VEGF在TBI後大量表現的轉錄因子，以及海馬迴中TBI誘導神經新生的主要因子。故在第二份實驗中，我們專注於探討影響TBI後HIF-1α表現量增加後的下游機制，特別是微小型片段RNA（microRNA, miR）是否在過程中扮演重要的角色。第二部分的實驗證明了miR-210在缺氧後參與了調節海馬迴中的神經新生。TBI後海馬迴中miR-210表現量迅速提升，約在4小時達到峰值，並在8小時內回復到基礎值。給予miR-210 shRNA不僅可有效的抑制miR-210的表現，同時也減少了TBI所引起的神經新生。此外，西方墨點法的結果顯示TBI誘導後MAPK 訊息傳遞路徑中，三個主要的蛋白質RAF-MEK-ERK的磷酸化均呈現增加，同樣的這些蛋白質的磷酸化情形，在經過miR-210 shRNA預處理後均恢復到正常範圍內。進一步探討TBI造成MAPK磷酸化改變的原因，發現海馬迴內的雙特異性去磷酸酶6 (dual specificity phosphatase 6, DUSP6)，還造成RAF-MEK-ERK訊息傳遞去磷酸化的主要磷酸酶，其表現量在TBI誘導後大量減少，我們推論miR-210可能會鍵結DUSP6的mRNA上進而造成其表現量下降。為了驗證上述假設，我們使用慢病毒紅螢光報告系統 (lentivirus report system)，該系統可藉由紅色螢光蛋白 (DsRed) 的表現來偵測miR-210是否會結合DUSP6 mRNA。結果發現DeRed蛋白質的表現在TBI前處理LV-DUSP6組中顯著地減少，證明了miR-210確實具有結合DUSP6 mRNA的能力，進而直接調控DUSP6的轉譯作用，使得在TBI後DUSP6減少，導致MAPK的磷酸化增加，進而促進神經新生的產生。綜合以上各項結果，我們認為miR-210可當作一個重要的生物指標，可用以探測TBI所引起的腦損傷；而TBI所造成的HIF-1α表現量增加，可進一步促進miR-210的產生，miR-210 可鍵結到DUSP6的mRNA上以減少其表現，進而導致MAPK的磷酸化增加，最終提升了TBI後海馬迴的神經新生。因此藉由增強或延長TBI誘導後HIF-1α的表現，應可作為研發針對TBI傷害的新型治療策略或藥物的重要標的。
顆粒性白血球群落刺激因子於慢性壓迫性神經損傷大鼠之止痛機轉
(2022) 廖洺鋒; Liao, Ming-Feng
位於周邊神經，背根神經節 (dorsal root ganglia，DRGs)及脊髓背角細胞(spinal dorsal horn，SDH)的各種不同發炎性介質，包含μ類鴉片受體 (mu-opioid receptor，MOR)、促炎性/抗炎性細胞素(pro-inflammatory/anti-inflammatory cytokine)、趨化素(chemokine)、小分子核糖核酸(microribonucleic acid，microRNA)和磷酸化-p38 (phospho-p38，p-p38) 在神經性疼痛的生成均伴有重要的角色。此外，細胞自噬(autophagy)及細胞凋亡(apoptosis)也調節了神經性疼痛的形成。顆粒性白血球群落刺激因子 (granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF) 是一種生長因子，可刺激周邊血液中顆粒性白血球的形成，對神經性疼痛有鎮痛的作用。它是經由聚集含鴉片類物質的白血球到受損神經處，並抑制DRGs上的pro-inflammatory cytokine來達成止痛效果。此外，G-CSF也以多種方式對microRNA的表現、autophagy及apoptosis的活性產生影響。然而，G-CSF詳細的鎮痛機轉，以及pro-inflammatory cytokine、chemokine、microRNA、autophagy和apoptosis在慢性神經疼痛形成中的角色則尚未完全明瞭。因此，我們藉由動物疼痛行為測試，西方墨點法，酵素免疫分析法和免疫組織化學方法在神經損傷後的不同時間點（分別為神經損傷後1、3 和 7 天）分析假手術，接受與非接受G-CSF治療的慢性壓迫性神經損傷大鼠之受損周邊神經及DRGs上MOR、pro-inflammatory cytokine、chemokine、microRNA、autophagy和apoptosis蛋白質，及SDH上p-p38和pro-inflammatory cytokine的表現。結果顯示，在神經損傷後給予單次全身性的G-CSF治療後，可在神經受傷的初期促進受損周邊神經及DRGs上的MOR、microRNA-122、和細胞自噬蛋白質(autophagy protein: microtubule-associated protein light chain 3-II ，LC3II)的表達。然後這一系列的變化不但抑制了DRGs上的pro-inflammatory cytokine及chemokine (monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)的表現，並且在神經受傷的後期抑制了DRGs上的apoptosis蛋白質的表現，以及抑制SDH上的p-p38、pro-inflammatory cytokine (interleukin-6，IL-6) 的活性；唯增強了SDH上anti-inflammatory (interleukin-4，IL-4)的表現，藉此減輕神經性疼痛。因此，G-CSF 可以作為調節受損周邊神經、DRGs、SDH上pro-inflammatory cytokine、chemokine、microRNA、autophagy和apoptosis蛋白質表達的藥物，並進一步成為具有治療神經性疼痛潛力的藥物。然而，autophagy的神經性疼痛調節作用具有時間依賴性，必須在pro-inflammatory cytokine達到誘發神經性疼痛的閾值前的神經受傷初期階段，增加autophagy活性才可以有效抑制pro-inflammatory cytokine和apoptosis蛋白質的表達，藉此緩解神經性疼痛的進一步的發展。