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Item 1. 抑制肺癌腫瘤細胞增生的新穎小分子藥物篩選及其反應機制2. 玫瑰樹鹼對肺癌細胞誘導Akt及p53核移動及生長抑制(2012) 游雅竹; Ya Chu Yu1.本論文使用肺癌細胞株為模式，自42個化學合成有機小分子，利用細胞生長速率測試 (MTT assay)，篩選出在低濃度下可以降低細胞生長速率之藥物。其中oxazoline衍生物MZ-01-059能夠有效在5 μM下降低A549細胞的生長速率。次由細胞群落分析證實MZ-01-059可以抑制癌細胞的增生。為了確認非小細胞肺癌的生長率下降是否與細胞凋亡相關，實驗再利用propidium iodide染色後DNA，進行後流式細胞分析，觀察細胞週期變化。實驗結果顯示MZ-01-059會讓具有野生型p53之細胞株A549及H460產生細胞凋亡。其中以H460細胞株較為顯著；但對不具有p53之H1299細胞，則會停滯在S及G2/M週期。另由二維流式細胞儀分析結果，確立H460肺癌細胞主要是以晚期細胞凋亡 (late apoptosis) 方式降低細胞存活率。由西方轉漬法鑑定與細胞凋亡相關的蛋白，發現MZ-01-059處理後細胞，會活化腫瘤抑制基因p53，此外也會使pro-caspase-3以及poly ADP ribose polymerase切割；而LC3-II (microtubule-associated protein 1 light chain 3) 在A549及H1299細胞株會增加，因此推斷這兩種細胞是先以細胞自噬保護細胞，再產生細胞凋亡，證實這個藥物所引發細胞凋亡與細胞自噬相關。本論文結果也顯示MZ-01-059能夠在低濃度下誘導活化在非小細胞肺癌引發不同程度的細胞凋亡，且與p53活化有關。 2.拓樸異構酶II抑制劑玫瑰樹鹼 (ellipticine) 為具有抑制癌細胞生長的抗癌藥物，本實驗室過去研究指出藥物可經由活化p53，使人類非小細胞肺癌A549細胞株凋亡。本論文持續探討細胞生長因子Akt對於p53進入細胞核的影響，研究使用轉殖p53質體至H1299的穩定細胞株 (HW16)。但當加入外源Akt會增加ellipticine對細胞生長的抑制效應，並讓sub G1週期細胞數目上升，而Akt及p53會被共同誘導移入細胞核內，DNA修補酶PARP也受到剪切。但將AktS473位點突變後，誘導產生的細胞凋亡會被抑制；而AktT308位點突變後抑制能力則較不明顯。Ellipticine所引發的細胞凋亡也與細胞自噬的形成有關，加入Akt後細胞內LC3-I轉換成LC3-II的比例增加，但當AktS473位點突變後，所誘導的細胞自噬也會降低。因此本研究顯示ellipticine所誘導產生的細胞凋亡是與Akt及p53移動至細胞核及細胞自噬形成有關，且AktS473位點的磷酸化對於藥物引發的細胞凋亡具有重要性。Item 三環藥物Teroxirone對非小細胞肺癌細胞增生機制的探討(2012) 林楷涵; Kai-Han Lin肺癌細胞依其組織型態可分為兩類:小細胞肺癌 (small cell lung cancer, SCLC) 以及非小細胞肺癌 (non-small cell lung cancer, NSCLC)，而其中大多數屬於非小細胞肺癌。目前在臨床治療上經常使用的抗癌藥物 (例如: camptothecin, doxorubicin, etoposide, cisplatin) 容易產生抗藥性，導致治療的困難，因此本文開發目前臨床上還未徹底了解，但具有抗癌效果的化合物。 研究目標是發展小分子且低劑量的三環氧化物teroxirone，了解teroxirone如何引發細胞凋亡。實驗以MTT及細胞群落分析 (colony formation assay) 確認teroxirone確實能降低非小細胞肺癌的存活率。接著要確認非小細胞肺癌細胞的存活率下降的確是由於細胞凋亡所造成。再利用單細胞凝膠電泳 (single cell gel electrophoresis (SCGE) / comet assay)，偵測teroxirone是否造成DNA 損傷。再利用propidium iodide (PI) 染色觀察teroxirone對細胞週期的影響，再利用二維流式細胞儀及DNA片段化實驗觀察teroxirone所誘導的細胞凋亡。 實驗結果顯示，teroxirone都會對NSCLC細胞造成不同程度DNA損傷，且細胞凋亡與p53的基因型有關。Item 一、探討新穎Indolylquinoline衍生物誘導非小細胞肺癌細胞凋亡機制 二、鑑定具有清除肺癌幹細胞的藥物(2014) 巫佩岑; Pei-Tsen Wu一.過去研究利用MTT assay以非小細胞肺癌細胞 (non-small cell lung cancer, NSCLC) 為平台篩選了逾五百種小分子化合物，發現含有indole 及quinoline這兩種官能基的小分子化合物compound A，於低劑量下，會抑制A549及H460這兩株NSCLC細胞生長速率及抑制A549腫瘤生長，但對抑癌基因p53缺失的H1299細胞株則無影響，接著使用western blot, MTT及flow cytometry，證實此藥物會誘導表現野生型p53的細胞產生凋亡，但是p53缺失的H1299細胞對此藥物的敏感度較低，而且不會出現凋亡。本論文內容是繼續探討此藥物對NSCLC細胞的調控生長機制與p53基因型的相關性。實驗主要是將p53缺失的H1299，分別轉殖入p53 DNA-binding domain 位點突變的p53R267P以及野生型p53的細胞株，其次再使用MTT 實驗，發現以此藥物10 µM處理H1299轉殖野生型p53細胞48小時後的生長速率較轉殖p53R267P敏感度高35％，繼續使用propidium iodide及Annexin V進行實驗，證實轉殖野生型p53細胞生長率的降低，是細胞凋亡造成，但以此藥物10 µM處理H1299/p53R267P細胞48小時後，細胞凋亡數目比例較H1299/p53細胞降低39.2％，最後由western blot確認細胞凋亡與p53及其下游poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) 裂解及caspase-3活化的蛋白質相關。這些實驗結果證明此藥物對表現野生型p53的H1299/p53細胞有最佳的治療效果，且野生型p53功能在此藥物誘導的凋亡機制中扮演了重要角色。未來實驗中將持續探討compound A如何降低腫瘤細胞生長，實驗會以癌症類幹細胞為模式，持續研究抑制腫瘤生長及轉移的機制。 二.中草藥療法在近幾年被重視，因為以中草藥搭配放射療法能減低癌症病患副作用，提升體質。本實驗以可能具有較高轉移能力及抗藥性的肺癌類幹細胞為模式，研究中藥苦參 (Sophora flavescens) 、鴨膽子 (Brucea javanica)、夏枯草 (Prunella vulgaris) 及西藥teroxirone 如何抑制肺癌類幹細胞生長。本實驗觀察幹細胞表面標誌Nanog，確認肺癌類幹細胞平臺的建立，接續使用螢光顯微鏡觀察幹細胞在這些藥物處理下，H460, H1299/p53及A549肺癌類幹細胞會隨藥物濃度及時間增加，其數目及形狀明顯的變少及變小，表示具有抑制肺癌類幹細胞生長的潛力，最後再以western blot實驗確認teroxirone會誘導H460肺癌類幹細胞走向p53依賴的細胞凋亡路徑。於先前研究中已知夏枯草可降低肝癌細胞的轉移力，苦參及鴨膽子可抑制A549腫瘤生長，此外，低劑量的teroxirone可抑制肺癌細胞生長及誘導細胞凋亡，所以日後將持續以此類模式探討這些藥物是否能抑制肺癌類幹細胞生長以及降低轉移能力。Item 利用非小細胞肺癌細胞以及動物模式探討中草藥之治療潛力(2013) 韋會妤; Hui-Yu Wei非小細胞肺癌在肺癌中具有高發生率與致死率。文獻報導有許多中草藥含抑制腫瘤生長、血管新生和轉移的能力，同時伴隨較少的副作用。我們先前從十五種臨床上常用的中藥複方中，篩檢出三種對非小細胞肺癌細胞具有抑制能力的複方，分別為三號、五號及十四號藥方。已知此三種複方會造成A549細胞週期停滯進而抑制細胞的生長。我們更進一步使用非小細胞肺癌細胞株H460以及H520為細胞模式，評估這三種複方是否對非小細胞肺癌細胞具有一致的抑制效果，並以A549細胞株於雄性裸鼠進行腫瘤異種移植動物模式，以評估藥方的抗癌效果。在細胞模式中，我們利用細胞存活率(MTT assay)檢測十四號複方對非小細胞肺癌細胞株H460以及H520的半致死率，分別為4.5% 跟3.8%。此外，我們也發現十四號複方具有抑制細胞群落形成，以及造成細胞週期停滯在G1與G2的現象。在異種移植動物模式中，我們投予三種複方後發現三號以及十四號複方可減少腫瘤的大小，以西方墨點轉漬法進一步探討複方藥物處理的結果，我們發現這兩種複方可能藉由將腫瘤內細胞停滯在G2細胞週期以及誘導細胞凋亡的發生。本實驗的結果提供細胞以及動物實驗模式的結果顯示三號以及十四號複方可能具有抗腫瘤的潛力。Item 對苯二胺對於膀胱造成損害情形之研究(2013) 陳恬文; Tien-Wen Chen在現今社會，化學物質對苯二胺 (para-phenylenediamine; PPD) 因具有使毛髮氧化脫色之能力，因此常會被添加於一般民眾所使用之永久性染髮劑中。然而，PPD的使用長期以來被認為對於膀胱功能有所損害以及發生接觸性皮膚炎。為了釐清PPD對於膀胱造成的可能損害，我們使用腹腔注射的方式將PPD施打進入實驗動物體內為期一個月，以探討PPD對於膀胱功能的影響。藉由膀胱頂部插管以固定流速注入生理食鹽水的方式，進行膀胱壓力檢測；除此之外，為了更深入探討PPD所引起的傷害性，我們抽取了實驗動物的血液以及尿液樣本進行自由基數量的檢測，以及進行膀胱活體自由基數量檢測，此外也採得實驗動物的檢體進行病理切片觀察與使用西方墨點法進行計劃性細胞死亡之相關蛋白定量。而實驗結果顯示出，PPD會使膀胱收縮變得頻繁，也會造成血液與膀胱內部的氧化壓力增加。從病理切片發現到，PPD會使膀胱產生發炎。而西方墨點法結果也顯示：PPD會誘發兩種計畫性細胞死亡(細胞凋亡與細胞自我吞噬)。綜合上述結果可得知，PPD不僅會造成膀胱收縮功能的異常，也會促使血液中氧化壓力的上升以及膀胱組織的發炎，更會進一步使膀胱組織產生兩種不同路徑之計畫性細胞死亡。Item 錳離子在ICR小鼠視網膜毒性之研究(2014) 林天宇; Tian-Yu Lin本研究主要在於探討過量錳離子對ICR小鼠視網膜功能之影響。錳離子在動物體內需求極微量但卻不可或缺，過量的錳進入體內會造成中毒。過去對錳中毒的研究大多著重在呼吸系統、中樞神經系統損傷及發炎等臨床現象，對於視覺系統的研究非常少，對於錳的急性影響研究更少。本研究是利用眼瞼下注射 (subconjunctival injection)的方式，將生理食鹽水（control)、40 mM MnCl2 及 80 mM MnCl2注入眼球，觀察注射後在第一天、第三天及第七天，以不同強度光源的刺激，觀察小鼠視網膜電位 (ERG) a-wave與b-wave的振幅與隱含期的反應，以評估檢測視網膜功能是否受到影響。進一步再利用H&E染色，評估視網膜各層構造，探討視網膜的哪一層細胞可能受到影響，也利用免疫組織染色技術，以cleaved caspase-9、cleaved caspase-3、cleaved PARP、TNF-α、Bax、Bcl-2等抗體，來評估視網膜細胞受傷害的程度，結果顯示，眼瞼下注射不論在40 mM或80 mM MnCl2的濃度，確實都會造成視網膜功能受損，結果顯示ERG的a-wave 和 b-wave振幅 (amplitude)降低、隱含期 (implicit tim)延長，視網膜組織受損，從ChAT表現推測眼壓應沒有升高，免疫染色呈現視網膜可能發炎，也不能排除細胞發生凋亡的可能性。這些結果顯示MnCl2處理眼球，短時間的急性毒害可能是引起視網膜發炎、甚至細胞凋亡，因而引起ERG的a-wave與b-wave發生改變。Item 中草藥抑制細胞興奮性毒殺以治療第十七型脊髓共濟失調症(2014) 游賀培; He-pei You在神經退化性疾病中過量麩胺酸誘導受器活化與神經細胞損傷具有關聯性，從過去文獻中發現在小腦脊髓萎縮症 (Spinocerebellar ataxia, SCA) 細胞模式中，當活化麩胺酸受器會使得胞外鈣離子大量流入細胞質中，影響粒線體致使其功能損傷，進而誘發細胞凋亡路徑，引發細胞死亡。其中 SCA17 其之發病機制為 TATA 結合蛋白 (TBP) 中多麩醯胺酸 (>42 glutamines) 擴增，無法有效與 DNA 結合，並與轉錄因子蛋白質結合導致轉錄活性受到抑制，細胞內蛋白質異常聚集，產生細胞壓力，最後引發細胞死亡；此外，亦發現鈣離子有大量流入細胞內的情況。本研究的目的篩選出對於神經退化性疾病具有改善作用之中草藥及其成分。實驗以 SH-SY5Y 神經母細胞瘤細胞為細胞模式，篩選各種中草材及其成分對於麩胺酸誘導細胞產生興奮性毒殺是否具有改善作用。以 MTT 和流式細胞儀分析方法，我們發現 NH043-1 有效降低麩胺酸誘導所造成的細胞死亡；從西方墨點法中，觀察 NH043-1 可以降低麩胺酸誘導六小時之後 Bax, Calpain-2 和 SBDPs 的表現量而 Bcl-2 的表現量有上升的趨勢；二十四小時之後cleaved-PARP, cleaved-caspase-3 與 cleaved-caspase-9 的表現量有降低的趨勢。以 CL 冷光偵測儀，觀察 NH043-1 可以有效降低細胞內的自由基含量。利用流式細胞儀檢測粒線體膜電位，發現 NH043-1 可以提升粒線體膜電位。在誘導 nTBP/Q79-EGFP 融合蛋白表現的 SCA17細胞模式上，NH043-1 可以增加細胞的存活率以及 cleaved caspase-9, cleaved caspase-3 與cleaved PARP的表現量有降低的趨勢。在西方墨點法和 Dot-blot 方法，觀察 NH043-1 可以有效降低 TBP 蛋白質的異常聚集。在動物實驗部分使用 8 周大的 SCA17 轉殖基因老鼠從第九週開始注射 NH043-1，從 Rotarod assay 實驗發現在第 16, 18 及 20 周能夠有效延長其在 rotarod 上的時間，在 footprint assay 實驗上也改善步行缺失，並且在實驗小鼠小腦組織內有缺陷的 TBP 蛋白質的異常聚集和cleaved-caspase-3 表現量都有減緩。據以上的結果，NH043-1 可以改善麩胺酸誘導所造成的細胞死亡，具有治療 SCA17 之潛力。Item 中草藥抑制細胞興奮性毒殺模式以治療第十七型脊髓小腦共濟失調症(2013) 徐銘亨神經退化性疾病 (neurodegeneration diseases) 當中存在著由麩醯胺酸活化的興奮性毒殺 (excitotoxicity) ，如多麩醯胺酸疾病 (polyglutamine diseases) 、阿茲海默氏症疾病 (Alzheimer’s diseases) 和柏金森氏症疾病 (Parkinson’s disease) ，會導致過多的鈣離子流入、粒線體內細胞色素 C 的釋放、導致神經細胞凋亡的蛋白質活化，最後使細胞存活率的下降。許多研究報導指出，中草藥的使用，可能是一個治療退化性疾病新方法。因此，我們研究在人類神經母細胞 (neuroblastoma) SH-SY5Y 細胞以麩醯胺酸 (glutamate) 誘導的興奮性毒殺以及使用多西環素 (doxycycline) 誘導出小腦脊髓萎縮症第十七型 (Spinocerebellar ataxia, SCA17) nTBP/Q79-EGFP 細胞中 TBP/79Q-EGFP 融合蛋白的表現後，探討中草藥是否有保護神經細胞的作用。加入麩醯胺酸後導致神經細胞生存率下降，另一項實驗結果顯示NH018和其純化物NH018-1可能為有效的藥物可以增加神經細胞的存活率、NH018-1可以抑制神經細胞的凋亡 (apoptosis) 、降低乳酸脫氫酶 (LDH) 的釋放以及自由基的生成，並且降低鈣離子所造成的Calpain-2 及 α-spectrin breakdown products (SBDPs) 的表現，降低從粒線體釋放出的細胞色素C、增加細胞存活相關蛋白質：Bcl-2、Bax及降低凋亡相關：蛋白質 cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3和cleaved-PARP等的表現。在誘導TBP/79Q-EGFP 融合蛋白表現的細胞上，NH018-1為有效的藥物可以增加細胞的存活率以及降低cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3和cleaved-PARP等的表現。而施打NH018-1藥物在SCA17的基因轉殖鼠上，能夠有效地延長其在滾輪 (rotarod) 上面跑的時間、步行實驗 (footprint) 上的好轉，在其運動失調的症狀上發揮療效，以及降低 TATA box-binding protein (TBP) 、 Calpain-2 和 cleaved-caspase-3的表現。總合以上，實驗結果顯示出NH018和NH018-1藥物在加入麩氨酸以及誘導出小腦脊髓萎縮症第十七型細胞TBP/79Q-EGFP 融合蛋白的表現後，藉由抑制細胞的凋亡可以增加 SH-SY5Y 細胞以及小腦脊髓萎縮症第十七型細胞的存活率，因此NH018和NH018-1可能為有潛力治療小腦脊髓萎縮症第十七型疾病的藥物。Item 果蠅的TBP功能缺失所導致的細胞凋亡是透過氧化壓力及p53的活化(2013) 楊進勝; Chin-Sern Yong先前研究發現TATA box binding protein gene (TBP) 失去功能，會導致老鼠和斑馬魚早期發育停止及細胞凋亡。TBP如何調控動物發育及細胞凋亡的機制目前並不很清楚的，本論文的主要目的在於研究TBP導致細胞凋亡的性狀在果蠅是否保守，並了解其調控機制，我們發現TBP突變果蠅僅發育至胚胎晚期，且細胞死亡數大量增加。進一步分析TBP缺失細胞即為死亡細胞，顯見TBP對細胞凋亡的調控為自發性的，遺傳分析結果顯示，表現負顯性P53或DIAP1可抑制TBP缺失引起的細胞凋亡，反之大量表視TBP則可抑制P53引起之細胞死亡，顯示TBP為P53引發細胞凋亡作用路徑的成員；此外相較野生型，TBP突變果蠅的總蛋白質量和總核酸量並沒有顯著的減少，顯示TBP可能僅介由影響少數特定基因的表現造成細胞死亡，利用基因微陣列分析，TBP突變果蠅其Prx2540-2基因表現大量降低，Prx蛋白具水解過氧化氫(H2O2)活性，為細胞抵抗氧化壓力之重要成員。實驗發現TBP突變果蠅其過氧化氫濃度相較野生型果蠅為高，且餵食抗氧化劑可有效增長TBP突變株果蠅的生存壽命。綜言之，我們証實TBP功能缺失可籍由活化P53及氧化壓力造成細胞死亡。Item 透過活化p53引起人類非小細胞肺癌與肝癌細胞凋亡的吲哚喹嚀基藥物與其作用機制的探討(2016) 劉俊彥; Liu, Chun-Yen肺癌是全世界癌症中死亡率第一的癌症。非小型細胞肺癌（NSCLC）佔肺癌病患的比例約75％至80％。化療所造成的副作用與抗藥性在肺癌治療中是有待處理的棘手問題。因此發展出新的抗癌藥物對肺癌的病患是有必要的。此篇論文旨在篩選可抑制肺癌細胞生長新穎的合成化合物。透過MTT的分析方式鑑定EMMQ對非小型肺癌細胞的IC50的濃度。數據顯示低濃度的EMMQ即可減少A549和H460此兩種非小型肺癌細胞的生長速率。研究也證明，EMMQ可誘導具有正常p53基因的非小細胞肺癌的細胞凋亡，而且該藥物對p53-null的非小細胞肺癌則無明顯的效果。研究顯示EMMQ會誘導細胞DNA損傷，活化p53蛋白，干擾粒線體的膜電位而釋放細胞色素c，造成Bcl-2的下降，活化caspase-3， 讓PARP裂解而造成的內生性細胞凋亡。活體的實驗證明，EMMQ可以抑制裸鼠異種移植腫瘤的生長。最後，此研究證實EMMQ可在低濃度時活化非小細胞肺癌細胞的p53而造成細胞凋亡。此外，本研究還發現EMMQ可抑制具有正常 p53基因之非小細胞肺癌細胞的細胞轉移。因此本論文的數據顯示EMMQ可能成為一種新穎且有潛力的人類肺癌治療藥物。 肝癌是世界排名第五大常見的癌症。臨床顯示治療這些肝癌腫瘤中的重要的限制是治療過程中化療藥物長久投藥後的失效且肝癌對這些藥物產生抗藥性的問題。因此，開發肝癌治療中所產生化療失效與抗藥性的抗癌藥物是迫切需要的。之前我們已經確認EMMQ於肺癌細胞與活體的模式中是有效治療的效果。在此研究中證明EMMQ可抑制肝癌細胞的細胞生長進而誘導細胞凋亡。 EMMQ誘導的細胞凋亡為wild type p53的肝細胞癌（HCC）細胞，但是對mutant p53和p53-null細胞不敏感。數據顯示此化合物以內源性的途徑方式誘導細胞死亡。研究證明了EMMQ通過兩個主要途徑誘導細胞凋亡。此化合物使HepG2細胞的DNA損傷進而活化p53和γ-H2AX，降低cyclin D1和CDK 2的表現，導致細胞週期於G1期停滯。其次，此化合物使腫瘤抑制基因p53活化，干擾粒線體膜電位，使得ROS產生，Akt與 Bcl-2表現降低，Bax和細胞色素c的釋放，讓caspase-3和PARP裂解。細胞實驗的結果證明，在肝癌的治療上，EMMQ是一個有潛力的抗癌藥物。