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Subject: search.filters.subject.apoptosisStart date: 2010End date: 2019

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    以癌細胞株與動物模式探討吲哚結構化合物對於腫瘤細胞的生長抑制及其機轉
    (2011) 黃信銘; Sin-Ming Huang
    　　背景：前人研究指出，多種吲哚類化合物具有抑制細胞分裂的效果，進而導致癌細胞的細胞週期停滯和細胞凋亡。我們實驗室先前的研究證明，3-indole這個新穎的吲哚結構化合物可在30M的濃度下，藉由粒線體途徑（mitochondrial pathway）引起肺癌細胞凋亡，並在動物模式中抑制腫瘤生長。目的：本篇研究探討低濃度3-indole（10M）對癌細胞造成的生長抑制及其分子機轉。另外，我們也發展了另一個新穎的吲哚類化合物—SK228。我們利用細胞及動物模式，探討其對癌細胞生長的影響及其分子機轉。結果：在以10M 3-indole處理A549、CL1-1及H1437肺癌細胞株之後，發現癌細胞生長被抑制，並且造成細胞週期停滯於G1期。3-indole引起的DNA損傷由Comet assay所驗證，並且數種DNA損傷反應蛋白質及G1期調控蛋白質（例如RB、p53、p21和 SMAD3）在3-indole處理後表現量增加。我們進一步發現，3-indole也會引起DNA損傷反應路徑—ATM/ATR路徑的活化；另外，活性氧自由基（reactive oxygen species, ROS）的抑制劑rotenone能降低3-indole引起的DNA損傷和ATM/ATR反應路徑的活化。這些結果指出，ROS在3-indole引起的癌細胞生長抑制中，扮演重要的角色；動物異種移植（xenograft）實驗進一步證明，3-indole在細胞模式中活化的反應路徑，亦可見於動物模式中。在SK228的研究中，我們發現該化合物可有效的抑制肺癌及食道癌細胞生長，而對於正常肺纖維母細胞則無明顯影響。在以SK228處理過的細胞中，觀察到代表細胞凋亡的「細胞膜內膜外翻」的現象，指出SK228會引起細胞凋亡。我們進一步驗證了，SK228藉由與DNA的結合、鑲嵌及產生ROS而造成DNA的結構改變及損傷。SK228的處理會促進cytochrome c從粒線體釋放至細胞質中，以及caspase-3 和 caspase-9的活化，但不影響caspase-8的活性，並且這些反應可被ROS的抑制劑rotenone所抑制。另外，BCL-2家族的蛋白質表現量及粒線體外膜的完整性，亦受到SK228的影響。我們更進一步發現，SK228藉由降低FAK/paxillin路徑及RhoA的活性而抑制癌細胞的轉移能力。另外，動物實驗也證明SK228可有效抑制腫瘤細胞的生長，並且沒有引起明顯的體重變化或血液學、生化學上的明顯傷害。而且，藉由TUNEL assay和免疫組織化學染色證明，SK228可在動物模式中誘發癌細胞的細胞凋亡，進而抑制腫瘤生長。結論：本實驗證明，低濃度3-indole會藉由產生ROS而造成DNA損傷，並引起ATM/ATR路徑和TGF-β/SMAD路徑的活化，進而使細胞產生細胞週期G1期停滯現象。另外，SK228會藉由造成DNA損傷及ROS的產生而誘使癌細胞經由粒線體路徑進行細胞凋亡，並且也證明SK228可以在低濃度下有效抑制癌細胞的轉移能力。
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    PPP2R2B基因：啟動子記述及Bβ1/Bβ2 isoform在神經退化的角色
    (2010) 林志信; Chih-Hsin Lin
    　　PPP2R2B (亦稱為Bβ)廣泛表現在神經元，可調節去磷酸酶PP2A對tau及其他受質的去磷酸化作用。PPP2R2B基因5'端CAG重複擴增，導致體染色體顯性遺傳的神經退化性疾病第十二型小腦萎縮症。相反地，低轉錄活性且稀有短的等位基因，與台灣阿茲海默氏病和原發性顫抖症相關。本論文的第一部分在探討PPP2R2B基因CAG重複序列的角色，和鄰近cis要素及相關蛋白質調控PPP2R2B表現的情形。缺失/特定點突變、電腦模擬、cDNA 過度表現等實驗顯示，CREB1和SP1結合在CAG 重複的上游保守序列，來增加PPP2R2B的表現；然而TFAP4結合在CAG 重複的下游保守序列，來降低PPP2R2B的表現。DNA pull-down和染色質免疫沉澱-聚合酶連鎖反應等實驗進一步證實，CREB1、SP1和TFAP4結合在PPP2R2B起動子上。AT重複置換CAG重複的實驗顯示，CAG重複本身亦為一正調控PPP2R2B表現的cis要素。這些結果顯示CREB1、SP1和TFAP4在調節PPP2R2B表現中扮演角色，因此提供了一個調節PP2A活性的機制。論文的第二部分著重在建立穩定誘導表現Myc標籤的Bβ1/Bβ2細胞株，來探討Bβ調節的PP2A在神經退化中所扮演的角色。被誘導的Bβ1和Bβ2蛋白分別座落在細胞質和粒線體。Bβ細胞株的細胞週期分析顯示Bβ2表現的細胞，subG1和G2/M顯著增加，並伴隨著細胞存活率的顯著降低及cell division cycle (Cdc2)磷酸化的增加。表現Bβ2的細胞其特徵包括：活性氧自由基(ROS)和caspase 3活性增加、粒線體膜電位降低、Bax增加和cytochrome c由粒線體釋出至細胞質等，暗示Bβ2會誘導細胞自戕。抗氧化劑-tocopherol的添加可減弱ROS產生及cytochrome c釋放。總言之，這些結果顯示Bβ2能透過提升粒線體ROS的產生而誘導細胞凋亡。因此抑制Bβ2表現可能被發展為有潛能的治療策略，來治療與PP2A/Bβ2活性增加相關的神經退化性疾病。
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    1. 抑制肺癌腫瘤細胞增生的新穎小分子藥物篩選及其反應機制2. 玫瑰樹鹼對肺癌細胞誘導Akt及p53核移動及生長抑制
    (2012) 游雅竹; Ya Chu Yu
    1.本論文使用肺癌細胞株為模式，自42個化學合成有機小分子，利用細胞生長速率測試 (MTT assay)，篩選出在低濃度下可以降低細胞生長速率之藥物。其中oxazoline衍生物MZ-01-059能夠有效在5 μM下降低A549細胞的生長速率。次由細胞群落分析證實MZ-01-059可以抑制癌細胞的增生。為了確認非小細胞肺癌的生長率下降是否與細胞凋亡相關，實驗再利用propidium iodide染色後DNA，進行後流式細胞分析，觀察細胞週期變化。實驗結果顯示MZ-01-059會讓具有野生型p53之細胞株A549及H460產生細胞凋亡。其中以H460細胞株較為顯著；但對不具有p53之H1299細胞，則會停滯在S及G2/M週期。另由二維流式細胞儀分析結果，確立H460肺癌細胞主要是以晚期細胞凋亡 (late apoptosis) 方式降低細胞存活率。由西方轉漬法鑑定與細胞凋亡相關的蛋白，發現MZ-01-059處理後細胞，會活化腫瘤抑制基因p53，此外也會使pro-caspase-3以及poly ADP ribose polymerase切割；而LC3-II (microtubule-associated protein 1 light chain 3) 在A549及H1299細胞株會增加，因此推斷這兩種細胞是先以細胞自噬保護細胞，再產生細胞凋亡，證實這個藥物所引發細胞凋亡與細胞自噬相關。本論文結果也顯示MZ-01-059能夠在低濃度下誘導活化在非小細胞肺癌引發不同程度的細胞凋亡，且與p53活化有關。 2.拓樸異構酶II抑制劑玫瑰樹鹼 (ellipticine) 為具有抑制癌細胞生長的抗癌藥物，本實驗室過去研究指出藥物可經由活化p53，使人類非小細胞肺癌A549細胞株凋亡。本論文持續探討細胞生長因子Akt對於p53進入細胞核的影響，研究使用轉殖p53質體至H1299的穩定細胞株 (HW16)。但當加入外源Akt會增加ellipticine對細胞生長的抑制效應，並讓sub G1週期細胞數目上升，而Akt及p53會被共同誘導移入細胞核內，DNA修補酶PARP也受到剪切。但將AktS473位點突變後，誘導產生的細胞凋亡會被抑制；而AktT308位點突變後抑制能力則較不明顯。Ellipticine所引發的細胞凋亡也與細胞自噬的形成有關，加入Akt後細胞內LC3-I轉換成LC3-II的比例增加，但當AktS473位點突變後，所誘導的細胞自噬也會降低。因此本研究顯示ellipticine所誘導產生的細胞凋亡是與Akt及p53移動至細胞核及細胞自噬形成有關，且AktS473位點的磷酸化對於藥物引發的細胞凋亡具有重要性。
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    三環藥物Teroxirone對非小細胞肺癌細胞增生機制的探討
    (2012) 林楷涵; Kai-Han Lin
    肺癌細胞依其組織型態可分為兩類:小細胞肺癌 (small cell lung cancer, SCLC) 以及非小細胞肺癌 (non-small cell lung cancer, NSCLC)，而其中大多數屬於非小細胞肺癌。目前在臨床治療上經常使用的抗癌藥物 (例如: camptothecin, doxorubicin, etoposide, cisplatin) 容易產生抗藥性，導致治療的困難，因此本文開發目前臨床上還未徹底了解，但具有抗癌效果的化合物。 研究目標是發展小分子且低劑量的三環氧化物teroxirone，了解teroxirone如何引發細胞凋亡。實驗以MTT及細胞群落分析 (colony formation assay) 確認teroxirone確實能降低非小細胞肺癌的存活率。接著要確認非小細胞肺癌細胞的存活率下降的確是由於細胞凋亡所造成。再利用單細胞凝膠電泳 (single cell gel electrophoresis (SCGE) / comet assay)，偵測teroxirone是否造成DNA 損傷。再利用propidium iodide (PI) 染色觀察teroxirone對細胞週期的影響，再利用二維流式細胞儀及DNA片段化實驗觀察teroxirone所誘導的細胞凋亡。 實驗結果顯示，teroxirone都會對NSCLC細胞造成不同程度DNA損傷，且細胞凋亡與p53的基因型有關。
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    一、探討新穎Indolylquinoline衍生物誘導非小細胞肺癌細胞凋亡機制 二、鑑定具有清除肺癌幹細胞的藥物
    (2014) 巫佩岑; Pei-Tsen Wu
    一.過去研究利用MTT assay以非小細胞肺癌細胞 (non-small cell lung cancer, NSCLC) 為平台篩選了逾五百種小分子化合物，發現含有indole 及quinoline這兩種官能基的小分子化合物compound A，於低劑量下，會抑制A549及H460這兩株NSCLC細胞生長速率及抑制A549腫瘤生長，但對抑癌基因p53缺失的H1299細胞株則無影響，接著使用western blot, MTT及flow cytometry，證實此藥物會誘導表現野生型p53的細胞產生凋亡，但是p53缺失的H1299細胞對此藥物的敏感度較低，而且不會出現凋亡。本論文內容是繼續探討此藥物對NSCLC細胞的調控生長機制與p53基因型的相關性。實驗主要是將p53缺失的H1299，分別轉殖入p53 DNA-binding domain 位點突變的p53R267P以及野生型p53的細胞株，其次再使用MTT 實驗，發現以此藥物10 µM處理H1299轉殖野生型p53細胞48小時後的生長速率較轉殖p53R267P敏感度高35％，繼續使用propidium iodide及Annexin V進行實驗，證實轉殖野生型p53細胞生長率的降低，是細胞凋亡造成，但以此藥物10 µM處理H1299/p53R267P細胞48小時後，細胞凋亡數目比例較H1299/p53細胞降低39.2％，最後由western blot確認細胞凋亡與p53及其下游poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) 裂解及caspase-3活化的蛋白質相關。這些實驗結果證明此藥物對表現野生型p53的H1299/p53細胞有最佳的治療效果，且野生型p53功能在此藥物誘導的凋亡機制中扮演了重要角色。未來實驗中將持續探討compound A如何降低腫瘤細胞生長，實驗會以癌症類幹細胞為模式，持續研究抑制腫瘤生長及轉移的機制。 二.中草藥療法在近幾年被重視，因為以中草藥搭配放射療法能減低癌症病患副作用，提升體質。本實驗以可能具有較高轉移能力及抗藥性的肺癌類幹細胞為模式，研究中藥苦參 (Sophora flavescens) 、鴨膽子 (Brucea javanica)、夏枯草 (Prunella vulgaris) 及西藥teroxirone 如何抑制肺癌類幹細胞生長。本實驗觀察幹細胞表面標誌Nanog，確認肺癌類幹細胞平臺的建立，接續使用螢光顯微鏡觀察幹細胞在這些藥物處理下，H460, H1299/p53及A549肺癌類幹細胞會隨藥物濃度及時間增加，其數目及形狀明顯的變少及變小，表示具有抑制肺癌類幹細胞生長的潛力，最後再以western blot實驗確認teroxirone會誘導H460肺癌類幹細胞走向p53依賴的細胞凋亡路徑。於先前研究中已知夏枯草可降低肝癌細胞的轉移力，苦參及鴨膽子可抑制A549腫瘤生長，此外，低劑量的teroxirone可抑制肺癌細胞生長及誘導細胞凋亡，所以日後將持續以此類模式探討這些藥物是否能抑制肺癌類幹細胞生長以及降低轉移能力。
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    利用非小細胞肺癌細胞以及動物模式探討中草藥之治療潛力
    (2013) 韋會妤; Hui-Yu Wei
    非小細胞肺癌在肺癌中具有高發生率與致死率。文獻報導有許多中草藥含抑制腫瘤生長、血管新生和轉移的能力，同時伴隨較少的副作用。我們先前從十五種臨床上常用的中藥複方中，篩檢出三種對非小細胞肺癌細胞具有抑制能力的複方，分別為三號、五號及十四號藥方。已知此三種複方會造成A549細胞週期停滯進而抑制細胞的生長。我們更進一步使用非小細胞肺癌細胞株H460以及H520為細胞模式，評估這三種複方是否對非小細胞肺癌細胞具有一致的抑制效果，並以A549細胞株於雄性裸鼠進行腫瘤異種移植動物模式，以評估藥方的抗癌效果。在細胞模式中，我們利用細胞存活率(MTT assay)檢測十四號複方對非小細胞肺癌細胞株H460以及H520的半致死率，分別為4.5% 跟3.8%。此外，我們也發現十四號複方具有抑制細胞群落形成，以及造成細胞週期停滯在G1與G2的現象。在異種移植動物模式中，我們投予三種複方後發現三號以及十四號複方可減少腫瘤的大小，以西方墨點轉漬法進一步探討複方藥物處理的結果，我們發現這兩種複方可能藉由將腫瘤內細胞停滯在G2細胞週期以及誘導細胞凋亡的發生。本實驗的結果提供細胞以及動物實驗模式的結果顯示三號以及十四號複方可能具有抗腫瘤的潛力。
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    鑑定新藥物NCT016以治療阿茲海默症
    (2015) 游蕍甄; Yu Yu-Chen
    阿茲海默症（Alzheimer’s disease）是漸進性的神經退化性疾病，其病徵包括漸進性的記憶能力損失以及在大腦皮質和海馬迴等區域有類澱粉斑塊（amyloid plaque）產生。膽鹼性假說（cholinergic hypothesis）說明乙醯膽鹼（acetylcholine）的濃度下降會導致認知與記憶能力的損失。先前的研究顯示，當抑制乙醯膽鹼酯酶（acetylcholinesterase），水解乙醯膽鹼的酵素，可以提升腦部乙醯膽鹼的濃度，而改善AD病人腦中膽鹼神經（cholinergic neuron）之間的訊息傳導。目前用於治療AD的藥物當中乙醯膽鹼酯酶抑制劑仍佔有一席之地，其可改善病徵以及認知功能。所以本篇研究目的在於鑑定黃芩萃取物NCT016是否可以有效抑制乙醯膽鹼酯酶的活性來保護神經細胞的新穎藥物。本實驗使用的細胞模式是Tet-On Aβ42-GFP SH-SY5Y人類神經瘤母細胞，以及動物模式APP/PS1/tau的基因轉殖鼠來進行實驗。得到的初步結果顯示，在細胞模式中NCT016可以降低乙醯膽鹼酯酶的活性；藉由降低β-secretase （β-site APP-cleaving enzyme 1，BACE1）、類澱粉前驅蛋白C端片段蛋白（APP β-C-terminal fragments，β-CTF）和類澱粉蛋白（Aβ42）的表現量以減緩類澱粉蛋白產生途徑（amyloidogenic pathway）；增加粒線體膜電位並降低Bax/Bcl-2 ratio以改善粒線體的功能；降低cleaved caspase-9 和cleaved PARP的表現量避免細胞走向細胞凋亡（apoptosis）；並且增加神經纖維（neurite）的長度和複雜度以改善神經纖維生長（neurite outgrowth）。在動物模式中，NCT016可以改善基因轉殖鼠在空間上的學習與記憶能力以及短期記憶能力；降低其大腦中類澱粉前驅蛋白（APP）、BACE1和p-tau的表現量以及減緩粒線體調控的細胞凋亡路徑。總結來說，NCT016可作為治療阿茲海默症的藥物來抑制乙醯膽鹼酯酶的活性、類澱粉蛋白產生途徑和細胞凋亡路徑，並增加粒線體功能等。
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    鑑定新藥物NH040-1透過抑制神經細胞內質網壓力以治療第十七型脊髓小腦共濟失調症
    (2015) 鄭瑀萱; Yu-Hsuan Cheng
    第十七型小腦脊髓共濟失調症 (Spinocerebellar ataxia type 17; SCA17) 是一種由多麩醯胺(polyglutamine; polyQ)蛋白異常擴增所引起的神經退化性疾病，致病原因是在TATA box binding protein (TBP) 基因上CAG三核苷序列重複出現不正常擴增，因而轉譯出異常的polyQ蛋白表現；polyQ蛋白異常擴增造成蛋白質錯誤折疊及聚集(Aggregation)，另外未折疊及錯誤折疊蛋白若在內質網內堆積會引發內質網壓力 (Endoplasmic reticulum stress; ER stress)，而細胞會啟動未折疊蛋白反應 (Unfolded protein response; UPR) 保護機制以修復內質網功能，一旦壓力持續未解決，反而會誘發由內質網介導的凋亡路徑進而造成細胞死亡。此外內質網功能失調也會增加活性氧 (Reactive oxygen species; ROS) 的生成，誘發氧化壓力而加劇傷害。近年來，越來越多研究認為內質網壓力及氧化壓力可能參與第十七型小腦脊髓共濟失調症致病過程，且許多文獻指出，中草藥的使用具有治療退化性疾病之潛力。因此，本研究設計 (I)人類神經瘤母細胞 (Neuroblastoma SH-SY5Ycells) 以毒蘿蔔素 (Thapsigargin; TG) 及衣黴素 (Tunicamycin; TM) 誘導的內質網壓力、(II) SCA17 nTBP/Q79-EGFP細胞以多西環素 (Doxycycline)誘導出polyQ蛋白表現 (III) SCA17小鼠模式三階段實驗，鑑定金銀花 (Lonicera japonica)之有效成分NH040-1是否具有保護神經細胞的作用。實驗結果顯示NH040-1可增加由TG或TM所造成細胞死亡的生存率、可抑制神經細胞凋亡、可降低內質網壓力路徑相關蛋白的表現並可減少由內質網壓力產生的活性氧生成量，顯示NH040-1對內質網壓力誘導的細胞死亡具有改善效果；並進一步以多西環素誘導出的SCA17 nTBP/Q79-EGFP細胞，我們發現NH040-1可對Q79細胞型態退化有顯著改善效果、減少Q79細胞聚集的現象、且可降低內質網壓力誘導的細胞凋亡表現。實驗進一步轉移至SCA17基因轉殖小鼠上，藉由腹腔注射NH040-1藥物，透過滾輪、步行等實驗觀察其行為，結果顯示NH040-1能夠有效地促進其滾輪上之行為分析以及改善步行印跡，在其運動失調的症狀上發揮療效，並且可以減少基因轉殖小鼠小腦中TBP/polyQ 蛋白的不正常聚集及內質網壓力介導的細胞凋亡現象，以及改善Purkinje cells失序分佈。綜合以上實驗結果，NH040-1具有透過抑制內質網壓力及活性氧生成的表現，進而治療第十七型小腦脊髓共濟失調症的潛在能力。
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    對苯二胺對於膀胱造成損害情形之研究
    (2013) 陳恬文; Tien-Wen Chen
    在現今社會，化學物質對苯二胺 (para-phenylenediamine; PPD) 因具有使毛髮氧化脫色之能力，因此常會被添加於一般民眾所使用之永久性染髮劑中。然而，PPD的使用長期以來被認為對於膀胱功能有所損害以及發生接觸性皮膚炎。為了釐清PPD對於膀胱造成的可能損害，我們使用腹腔注射的方式將PPD施打進入實驗動物體內為期一個月，以探討PPD對於膀胱功能的影響。藉由膀胱頂部插管以固定流速注入生理食鹽水的方式，進行膀胱壓力檢測；除此之外，為了更深入探討PPD所引起的傷害性，我們抽取了實驗動物的血液以及尿液樣本進行自由基數量的檢測，以及進行膀胱活體自由基數量檢測，此外也採得實驗動物的檢體進行病理切片觀察與使用西方墨點法進行計劃性細胞死亡之相關蛋白定量。而實驗結果顯示出，PPD會使膀胱收縮變得頻繁，也會造成血液與膀胱內部的氧化壓力增加。從病理切片發現到，PPD會使膀胱產生發炎。而西方墨點法結果也顯示：PPD會誘發兩種計畫性細胞死亡(細胞凋亡與細胞自我吞噬)。綜合上述結果可得知，PPD不僅會造成膀胱收縮功能的異常，也會促使血液中氧化壓力的上升以及膀胱組織的發炎，更會進一步使膀胱組織產生兩種不同路徑之計畫性細胞死亡。
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    錳離子在ICR小鼠視網膜毒性之研究
    (2014) 林天宇; Tian-Yu Lin
    本研究主要在於探討過量錳離子對ICR小鼠視網膜功能之影響。錳離子在動物體內需求極微量但卻不可或缺，過量的錳進入體內會造成中毒。過去對錳中毒的研究大多著重在呼吸系統、中樞神經系統損傷及發炎等臨床現象，對於視覺系統的研究非常少，對於錳的急性影響研究更少。本研究是利用眼瞼下注射 (subconjunctival injection)的方式，將生理食鹽水（control)、40 mM MnCl2 及 80 mM MnCl2注入眼球，觀察注射後在第一天、第三天及第七天，以不同強度光源的刺激，觀察小鼠視網膜電位 (ERG) a-wave與b-wave的振幅與隱含期的反應，以評估檢測視網膜功能是否受到影響。進一步再利用H&E染色，評估視網膜各層構造，探討視網膜的哪一層細胞可能受到影響，也利用免疫組織染色技術，以cleaved caspase-9、cleaved caspase-3、cleaved PARP、TNF-α、Bax、Bcl-2等抗體，來評估視網膜細胞受傷害的程度，結果顯示，眼瞼下注射不論在40 mM或80 mM MnCl2的濃度，確實都會造成視網膜功能受損，結果顯示ERG的a-wave 和 b-wave振幅 (amplitude)降低、隱含期 (implicit tim)延長，視網膜組織受損，從ChAT表現推測眼壓應沒有升高，免疫染色呈現視網膜可能發炎，也不能排除細胞發生凋亡的可能性。這些結果顯示MnCl2處理眼球，短時間的急性毒害可能是引起視網膜發炎、甚至細胞凋亡，因而引起ERG的a-wave與b-wave發生改變。