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Item 中藥複方製劑芍藥甘草湯和Coumarin-chalcone衍生物在Tau蛋白易聚集表現之阿茲海默氏症細胞模式中之療效(2022) 林德嫻; Lin, Te-Hsien阿茲海默氏症(Alzheimer’s disease, AD)為一種進行性且不可逆的神經退化性疾病，受損的記憶和認知能力會逐漸失常最終造成身體功能的完全喪失。AD病人腦中最主要的特徵為不正常的Amyoild β與Tau蛋白聚集形成的老化斑塊(Senile plaque)和神經纖維纏結(Neurofibrillary tangles)。神經纖維纏結主要組成是高度磷酸化的Tau蛋白，而Tau蛋白的病變不僅在AD病人，也在許多Tauopathy中見到。在大腦中由於錯誤折疊形成的蛋白堆積，引發許多病理事件，例如氧化壓力、神經發炎，或是與神經細胞功能相關的訊息傳遞障礙，降低神經細胞存活。本篇研究主要是利用人類胚胎腎細胞HEK-293和神經纖維瘤母細胞SH-SY5Y，表現易聚集特性的ΔK280 TauRD片段蛋白，作為評估中藥製劑芍藥甘草湯(SG-Tang)以及Coumarin-chalcone衍生物LM-021、LM-031和LMDS-1~4化合物，抑制蛋白聚集、抗氧化和神經保護性的情形。芍藥甘草湯製劑，由甘草與白芍以等比例製成，除了可有效降低以LPS/IFN-γ刺激後活化的BV-2微膠細胞所釋出的NO、TNF-α、IL-1β及IL-6等前驅發炎細胞因子外，並可抑制由於誘導表現ΔK280 TauRD蛋白而上升的BAD、BID、CASP3、CASP8和CYCS表現，來達到Tau蛋白聚集抑制和神經保護性。其中LM-021除了本身有化學伴護活性可直接抑制ΔK280 TauRD的聚集外，還可透過PKA、CaMKII、ERK等路徑活化CREB和下游的BDNF、BCL2表現，來展現其神經保護之功能。接著在ΔK280 TauRD-DsRed SH-SY5Y細胞中，觀察到LM-031可提升HSPB1伴護蛋白表現以降低Tau蛋白的錯誤折疊，以及藉由活化NRF2/NQO1/GCLC和CREB調控之BDNF/AKT/ERK/BCL2路徑，來達到抑制細胞凋亡和促進細胞存活之效果。最後，因LM-031可提升CREB依存的BDNF表現，利用虛擬篩選找出LM-031類似化合物LMDS-1~4，並進一步以TRKB與ligand作用的d5-domain (PDB 1hcf)，以分子模擬計算LM-031類似化合物與此蛋白片段的結合構形。細胞實驗結果顯示，LMDS-1和LMDS-2可經由TRKB/ERK和TRKB/PI3K/AKT訊息路徑，增加CREB磷酸化及其下游BDNF、BCL2基因表現。總結來說，本研究結果顯示芍藥甘草湯的抗氧化和抗發炎活性，可抑制神經細胞凋亡，在Tau蛋白聚集的細胞中展現其神經保護的能力，而Coumarin-chalcone衍生物LM-031、LM-021、LMDS-1、LMDS-2，具有活化HSPB1、NRF2及/或TRKB的作用，來降低Tau蛋白的錯誤摺疊、抑制細胞凋亡和促進神經細胞存活。以上這些研究結果顯示了芍藥甘草湯和Coumarin-chalcone衍生物，應用在AD治療上的潛能。Item 以阿茲海默氏症小鼠初級細胞培養和動物模式評估具TrkB促效劑潛力化合物之治療效果(2021) 李佳瑜; Li, Chia-Yu阿茲海默氏症(Alzheimer' s disease, AD)是目前最常見的神經退化性疾病之一，至今尚無顯著有效的治療方法，該疾病會導致認知和行為問題，不論是對於個人或社會都造成極大的負擔。AD在病理學上主要有兩個病徵：類澱粉蛋白(β-amyloid peptides , Aβ)堆積成的斑塊(plaques)及Tau蛋白的過度磷酸化所導致的神經纖維糾結(neurofibrillary tingles, NFTs)。許多研究顯示AD病患腦中之腦源性神經滋養因子(Brain-derived neurotrophic factor, BDNF)濃度較正常人低，且此現象可讓更多的Aβ生成。BDNF結合其受體原肌球蛋白相關激酶B(tropomyosin-related kinase B, TrkB)可調節長期增益效應(long-term potentiation, LTP)、突觸可塑性和神經元分化等，因此增強BDNF/TrkB訊號傳遞成為AD治療之潛力策略。7,8-二羥基黄酮(7,8-dihydroxyflavon, 7,8-DHF)是目前已知的最佳TrkB促效劑，可與細胞膜上的TrkB受體結合並引發受體之同源二聚化而啟動下游之訊息傳導。本研究使用7種與7,8-DHF結構類似，以及8種與Coumarin結構相似之化合物，篩選出具潛力之TrkB促效劑。首先確定Aβ25-35對小鼠海馬迴初級細胞培養的有效傷害濃度為5 µM，以建立AD體外模式篩選平台；我們以此平台篩選出最具神經保護之化合物ZN014進入動物實驗。我們以透過立體定位注射Aβ25-35到小鼠海馬迴CA1區建立AD小鼠模型，再評估7,8-DHF與ZN014對AD動物模式之效用，用藥期間進行一系列行為實驗，結果顯示ZN014可有效改善Aβ25-35所導致的短期記憶受損。在病理與分子機制分析上，我們利用免疫組織化學染色和西方墨點法分析小鼠海馬迴組織，結果表示ZN014可改善Aβ25-35所導致的神經細胞缺失，也可以緩解小鼠海馬迴的神經發炎。ZN014可能是藉由降低神經發炎以保護神經，進而改善因Aβ25-35所導致的記憶受損。綜合上述結果ZN014也許可以開發成具有AD治療潛力的藥物。Item 探討神經醯胺對CaMKII相關訊息傳遞路徑和學習記憶的影響(2021) 葉佳旻; Yeh, Chia-Min神經醯胺是一種由鞘胺醇鹼骨架和不同碳鏈長度的脂肪酸組成的神經脂質，在許多生理過程中扮演非常重要的角色，例如調控訊號傳遞路徑。在過去的研究中，我們發現在野生型小鼠離乳後給予神經醯胺能增進成年後的記憶行為，利用初級培養的神經細胞也發現神經醯胺可增加CaMKII的磷酸化，CaMKII是一個與學習與記憶相關的蛋白質。本研究即探討神經醯胺在細胞層級的作用機制，以及利用阿茲海默症模式小鼠J20做為動物模式，探討在其離乳後給予神經醯胺是否可改善記憶缺失。結果顯示初級培養神經細胞給予神經醯胺刺激後，會使CaMKII磷酸化，且活化轉錄因子CREB以及活化Erk。而以目前的研究參數進行的實驗則發現神經醯胺並不會使神經細胞中鈣離子濃度產生變化。另外在更下游與表觀遺傳相關修飾的研究則發現給予神經醯胺可以使H3K4甲基化成H3K4 me3，並提高Egr1的表現量。將神經醯胺以皮下注射給予阿茲海默症模式小鼠J20，對小鼠的一些基本參數如體重、葡萄糖耐受性、發炎指標GOT、GPT以及組織切片觀察，發現給予神經醯胺並不影響上述生理參數。在動物行為方面，神經醯胺並不改善小鼠的焦慮行為，但可觀察到透過莫氏水迷津所檢測之短期空間記憶有顯著的進步。綜合以上，神經醯胺能使神經細胞中和記憶相關的蛋白質活化，且改善阿茲海默症模式小鼠J20的短期空間記憶，表示早期給予神經醯胺可能有助於學習與記憶的能力。Item 評估TrKB之潛力促效劑於阿茲海默氏症細胞與動物模式之神經保護效果(2019) 范家豪; Fan, Chia-Hao阿茲海默氏症(Alzheimer’s disease, AD)是目前最常見的神經退化性疾病之一，至今尚無顯著有效的治療方法。這種全球性的健康問題不論是對於個人或社會都有極大的影響。AD在病理學上主要有兩個病徵：類澱粉蛋白(β-amyloid peptides, Aβ)堆積成的斑塊(plaques)以及Tau蛋白過度磷酸化所導致的神經纖維糾結(neuro-fibrillary tangles, NFTs)。許多研究證實，在失智症病患腦中之腦源性神經滋養因子(Brain-derived neurotrophic factor, BDNF)濃度較低，且此現象可令更多的Aβ生成。BDNF及其受體原肌球蛋白相關激酶B(tropo-myosin-related kinase B, TrkB)，可調節長期增益效應(LTP)、長期抑制效應(long-term depre-ssion, LTD)、軸突出芽、樹突增生、突觸可塑性和神經元分化。7,8-二羥基黃酮(7,8-dihydroxyflavon, 7,8-DHF)是目前已知的TrkB促效劑，可與細胞膜上的TrkB受體結合並引發同源二聚化，啟動下游之訊息傳導。本研究是使用結構與7,8-DHF類似之12種新型的TrkB促效劑，經過MTT實驗評估發現12種促效劑對神經細胞都無明顯細胞毒性及神經突生長之影響。接著於小鼠海馬迴細胞初級培養給予Aβ25-35誘導神經損傷作為AD模式篩選平台，結果顯示LMDS-1能有效緩解因Aβ25-35寡聚體所導致的神經突長度及分支數目降低之現象，因此選擇LMDS-1進入動物實驗測試，並以7,8-DHF為正控制組。先利用立體定位注射Aβ25-35至小鼠海馬迴CA1區域以建立AD模式動物，再給予7,8-DHF或LMDS-1之處理，並於期間進行一系列行為實驗，結果顯示LMDS-1可有效改善因Aβ25-35誘導所導致的短期及長期記憶受損。在病理分析上，我們利用免疫組織化學染色和西方墨點法分析小鼠海馬迴組織，結果顯示LMDS-1可有效改善因Aβ25-35誘導所導致的Aβ堆積、成熟神經細胞缺失、pERK及synaptophysin表現量降低。由病理分析結果推論，LMDS-1可能是經由pY516TrkB活化Ras/MAPK路徑來激活CREB轉錄因子，進而上調mBDNF之表現量，改善因Aβ25-35所導致的記憶缺失。綜合上述結果，LMDS-1是具有治療AD潛力的新型TrkB促效劑，能夠改善動物記憶功能，並緩解AD代表性之病理特徵，希望能為日後AD研究提供一些新的方向與目標。Item 以amyloid-β 聚集為目標的阿茲海默氏症治療策略(2013) 黃鉦翔; Chen-Hsiang Huang阿茲海默氏症是最常見的老年癡呆症，主要臨床症狀包括Aβ胜肽聚集而成的細胞外澱粉樣蛋白斑與tau蛋白形成的細胞內神經纖維糾結。Aβ胜肽與tau蛋白的聚集往往是基於β-結構互相堆疊而形成。由於藉由破壞蛋白之間的氫鍵可能抑制蛋白聚集，故可能可以從吲哚、多酚類及其衍生物和中藥材篩選出潛在的Aβ胜肽聚集抑制劑。為了達成以上目的，本實驗利用thioflavin T分析法篩選人工合成之化合物。此外，於細胞層面上將Aβ42胜肽與GFP螢光蛋白的N端融合，用於反映Aβ42聚集之程度，並建立於SH-SY5Y細胞和293細胞中，篩選出Tet-On SH-SY5Y細胞與Tet-On 293細胞。Tet-On 293細胞被用來測試植物萃取物與天然或人工合成化合物，藉由綠色螢光訊號區別可延緩或抑制Aβ42聚集之抑制劑。本實驗使用Tet-On 293阿茲海默氏症細胞模式於高通量分析系統，並結合自動顯微鏡與圖像分析自動測試化合物的有效濃度。本實驗分析出10種植物萃取物與人工合成化合物，能提升Aβ42-GFP綠螢光之訊號，其中NTNU-043、NTNU-057、NTNU-059、NTNU-071、NC009-1以及NC009-2等較具潛力，能增加Hsp27蛋白表現，幫助抑制Aβ42聚集。Item PPP2R2B基因遺傳檢測,啟動子記述與單一鹼基多型性分析(2007) 劉若芸; Ju-yun LiuPPP2R2B基因轉譯出一個專一表現在腦部的去磷酸酶PP2A的調控次單位Bβ。當PPP2R2B基因5’端CAG三核苷酸不正常擴增時，會造成第十二型脊髓小腦運動失調症(SCA12)，但當抑制PP2A活性時，會使動物腦部Tau蛋白過度磷酸化，出現類阿茲海默氏症的症狀。先前本實驗室研究顯示，PPP2R2B基因上游-870 ~ +23序列可調節基因基礎表現，且台灣阿茲海默氏症患者中PPP2R2B基因5’端啟動子活性較低的(CAG)7等位基因頻率較正常人族群為高(2.8% vs. 0.2%)。本論文延續先前研究，首先擴大正常人及神經性疾病患者PPP2R2B基因CAG三核苷重複的遺傳資料庫，未發現任何擴增的等位基因，但在4位原發性顫抖症(2.0%)及1位舞蹈症(1.1%)患者，觀察到短的(CAG)5~7等位基因。其次分析PPP2R2B基因4 kb啟動子片段上4個單一鹼基多型性與阿茲海默氏症、原發性顫抖症感受性的相關性，各多型性基因型或等位基因在患者與正常人族群間沒有顯著差異，但-3170C/-2923A/-1905T/-428G單套型可能與阿茲海默氏症的感受性相關。在HEK-293、IMR-32細胞中，-4070 ~ +23的遠端啟動子的轉錄活性顯著低於-870 ~ +23近端啟動子，在SK-N-SH、HEK-293、IMR-32細胞中，(CAG)5~7的近端啟動子轉錄活性亦顯著低於(CAG)16者。Item 以tau 聚集為目標的阿茲海默氏症治療策略(2013) 陳炫江; Hsuan-Chiang Chen阿茲海默氏症是一種漸近性的神經退化性疾病，主要病理特徵包 括細胞外間質的Aβ 胜肽堆積，及細胞內高度磷酸化tau 形成的神經 纖維糾結。由於tau 聚集與阿茲海默氏症進程具相關性，因此透過抑 制或消除tau 聚集或可保護受影響之神經細胞。本研究構築tau 蛋白 微管結合重複區域(tauRD)之野生型(K18)及第280 位置賴胺酸缺失的 促tau 聚集突變型(ΔK280)與DsRed 紅螢光蛋白融合之tauRD-DsRed基因，來建立誘導表現tauRD-DsRed 之Tet-On 293 與Tet-On SH-SY5Y 細胞，作為藥物篩檢平台，來篩檢可抑制tauRD 聚集的抑制物，並對 這些具聚集抑制性的化合物或中草藥、植物萃取物等，檢測其神經保 護機制。在Tet-On 293 細胞誘導tauRD-DsRed 蛋白表現後，ΔK280 突變型細胞螢光亮度較野生型細胞顯著減少。以剛果紅(正控制組)處 理細胞後，突變型細胞的紅螢光亮度較野生型者更能有效提升。對於 293 促tau 聚集突變型細胞，在細胞數無顯著影響下， 前處理 NC009-1、-2、-3、-6、-7 (吲哚基喹啉化合物)、NTNU-003、-008 (GSK-3β抑制劑類似物)、NH021、NTNU-043、-057、-059、-224、NTNU-309、 -313、-319、-331、-379 (中草藥或植物萃取液)等皆可顯著提升DsRed 紅螢光亮度。以維他命A 酸誘導ΔK280 促tau 聚集突變型SH-SY5Y 細胞神經分化後，螢光顯微影像分析顯示神經突觸生長性狀(包含總 生長及突起數、分支數)較野生型K18 細胞顯著下降。以NC009-1、 -7 及NTNU-008 前處理突變型SH-SY5Y 細胞後，可顯著提升神經突 觸總生長性狀，並可提升HSP27 蛋白(NC009-1、-7)或GRP 78、HSP27 蛋白(NTNU-008)的表現。