學位論文
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Item 中藥複方製劑芍藥甘草湯和Coumarin-chalcone衍生物在Tau蛋白易聚集表現之阿茲海默氏症細胞模式中之療效(2022) 林德嫻; Lin, Te-Hsien阿茲海默氏症(Alzheimer’s disease, AD)為一種進行性且不可逆的神經退化性疾病，受損的記憶和認知能力會逐漸失常最終造成身體功能的完全喪失。AD病人腦中最主要的特徵為不正常的Amyoild β與Tau蛋白聚集形成的老化斑塊(Senile plaque)和神經纖維纏結(Neurofibrillary tangles)。神經纖維纏結主要組成是高度磷酸化的Tau蛋白，而Tau蛋白的病變不僅在AD病人，也在許多Tauopathy中見到。在大腦中由於錯誤折疊形成的蛋白堆積，引發許多病理事件，例如氧化壓力、神經發炎，或是與神經細胞功能相關的訊息傳遞障礙，降低神經細胞存活。本篇研究主要是利用人類胚胎腎細胞HEK-293和神經纖維瘤母細胞SH-SY5Y，表現易聚集特性的ΔK280 TauRD片段蛋白，作為評估中藥製劑芍藥甘草湯(SG-Tang)以及Coumarin-chalcone衍生物LM-021、LM-031和LMDS-1~4化合物，抑制蛋白聚集、抗氧化和神經保護性的情形。芍藥甘草湯製劑，由甘草與白芍以等比例製成，除了可有效降低以LPS/IFN-γ刺激後活化的BV-2微膠細胞所釋出的NO、TNF-α、IL-1β及IL-6等前驅發炎細胞因子外，並可抑制由於誘導表現ΔK280 TauRD蛋白而上升的BAD、BID、CASP3、CASP8和CYCS表現，來達到Tau蛋白聚集抑制和神經保護性。其中LM-021除了本身有化學伴護活性可直接抑制ΔK280 TauRD的聚集外，還可透過PKA、CaMKII、ERK等路徑活化CREB和下游的BDNF、BCL2表現，來展現其神經保護之功能。接著在ΔK280 TauRD-DsRed SH-SY5Y細胞中，觀察到LM-031可提升HSPB1伴護蛋白表現以降低Tau蛋白的錯誤折疊，以及藉由活化NRF2/NQO1/GCLC和CREB調控之BDNF/AKT/ERK/BCL2路徑，來達到抑制細胞凋亡和促進細胞存活之效果。最後，因LM-031可提升CREB依存的BDNF表現，利用虛擬篩選找出LM-031類似化合物LMDS-1~4，並進一步以TRKB與ligand作用的d5-domain (PDB 1hcf)，以分子模擬計算LM-031類似化合物與此蛋白片段的結合構形。細胞實驗結果顯示，LMDS-1和LMDS-2可經由TRKB/ERK和TRKB/PI3K/AKT訊息路徑，增加CREB磷酸化及其下游BDNF、BCL2基因表現。總結來說，本研究結果顯示芍藥甘草湯的抗氧化和抗發炎活性，可抑制神經細胞凋亡，在Tau蛋白聚集的細胞中展現其神經保護的能力，而Coumarin-chalcone衍生物LM-031、LM-021、LMDS-1、LMDS-2，具有活化HSPB1、NRF2及/或TRKB的作用，來降低Tau蛋白的錯誤摺疊、抑制細胞凋亡和促進神經細胞存活。以上這些研究結果顯示了芍藥甘草湯和Coumarin-chalcone衍生物，應用在AD治療上的潛能。Item 評估TrKB之潛力促效劑於阿茲海默氏症細胞與動物模式之神經保護效果(2019) 范家豪; Fan, Chia-Hao阿茲海默氏症(Alzheimer’s disease, AD)是目前最常見的神經退化性疾病之一，至今尚無顯著有效的治療方法。這種全球性的健康問題不論是對於個人或社會都有極大的影響。AD在病理學上主要有兩個病徵：類澱粉蛋白(β-amyloid peptides, Aβ)堆積成的斑塊(plaques)以及Tau蛋白過度磷酸化所導致的神經纖維糾結(neuro-fibrillary tangles, NFTs)。許多研究證實，在失智症病患腦中之腦源性神經滋養因子(Brain-derived neurotrophic factor, BDNF)濃度較低，且此現象可令更多的Aβ生成。BDNF及其受體原肌球蛋白相關激酶B(tropo-myosin-related kinase B, TrkB)，可調節長期增益效應(LTP)、長期抑制效應(long-term depre-ssion, LTD)、軸突出芽、樹突增生、突觸可塑性和神經元分化。7,8-二羥基黃酮(7,8-dihydroxyflavon, 7,8-DHF)是目前已知的TrkB促效劑，可與細胞膜上的TrkB受體結合並引發同源二聚化，啟動下游之訊息傳導。本研究是使用結構與7,8-DHF類似之12種新型的TrkB促效劑，經過MTT實驗評估發現12種促效劑對神經細胞都無明顯細胞毒性及神經突生長之影響。接著於小鼠海馬迴細胞初級培養給予Aβ25-35誘導神經損傷作為AD模式篩選平台，結果顯示LMDS-1能有效緩解因Aβ25-35寡聚體所導致的神經突長度及分支數目降低之現象，因此選擇LMDS-1進入動物實驗測試，並以7,8-DHF為正控制組。先利用立體定位注射Aβ25-35至小鼠海馬迴CA1區域以建立AD模式動物，再給予7,8-DHF或LMDS-1之處理，並於期間進行一系列行為實驗，結果顯示LMDS-1可有效改善因Aβ25-35誘導所導致的短期及長期記憶受損。在病理分析上，我們利用免疫組織化學染色和西方墨點法分析小鼠海馬迴組織，結果顯示LMDS-1可有效改善因Aβ25-35誘導所導致的Aβ堆積、成熟神經細胞缺失、pERK及synaptophysin表現量降低。由病理分析結果推論，LMDS-1可能是經由pY516TrkB活化Ras/MAPK路徑來激活CREB轉錄因子，進而上調mBDNF之表現量，改善因Aβ25-35所導致的記憶缺失。綜合上述結果，LMDS-1是具有治療AD潛力的新型TrkB促效劑，能夠改善動物記憶功能，並緩解AD代表性之病理特徵，希望能為日後AD研究提供一些新的方向與目標。