學位論文
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Item 以斑馬魚為動物模式研究奈米金屬對離子細胞之毒性(2021) 李致穎; Lee, Chih-Ying在21世紀，奈米科技快速發展，應用廣泛，而這也同時增加了人類接觸各種不同奈米顆粒的機會，因此針對其毒性的研究，也相形越來越重要。而其中，金屬奈米顆粒對於魚類離子細胞的潛在毒性仍未有充分的研究。本篇研究是以斑馬魚胚胎為動物模式，探討奈米銀和奈米銅對斑馬魚胚胎皮膚上的離子細胞功能之毒性作用。實驗方式是將斑馬魚的胚胎分別浸泡於奈米銀和奈米銅96小時（受精後4〜100小時(hpf)）後，檢測其全身離子含量及皮膚上離子細胞的數量和功能。暴露於奈米銀96小時後，全身Na離子和K離子含量在奈米銀濃度為3 mg/L組別中顯著下降，而Ca離子含量在濃度 ≥ 0.1 mg/L時下降。以Scanning ion-selective electrode technique(SIET)檢測胚胎皮膚的H離子分泌功能，發現在3 mg/L時功能顯著降低。以rhodamine 123（粒線體標記）來標記離子細胞，其密度在1和3 mg/L時分別降低了25%和55%，而離子細胞外觀也從橢圓形變形為棘狀形。進一步以抗體標記染色的方式檢測不同離子細胞亞型，發現奈米銀對富含H+-ATPase的HR細胞和富含Na+/K+-ATPase的NaR細胞造成不同的損傷。進一步使用掃描電子顯微鏡觀察離子細胞，其頂端開口有明顯的萎縮，這和正常功能的喪失相關。另一方面，斑馬魚胚胎暴露於奈米銅後，觀察到相同的趨勢。濃度在 ≥ 0.1 mg/L時，全身Na離子和Ca離子含量顯著降低，而在 ≥ 1 mg/L時，K離子含量降低。而濃度 ≥ 1 mg/L時，胚胎皮膚的H離子排泄功能顯著降低。在奈米銅濃度 ≥ 0.1 mg/L時，用rhodamine 123標記的活離子細胞數量顯著減少。使用掃描電子顯微鏡觀察離子細胞，其頂端開口同樣有明顯的萎縮。我們也以免疫染色方式進行離子細胞亞型(HR細胞和NaR細胞) 標記，兩者都在濃度 ≥ 1 mg/L時降低。透過檢測離子轉運蛋白/通道和鈣離子調節激素mRNA表現量，發現功能的損傷也藉由基因表達的變化反映出來。綜合以上結果證實在斑馬魚胚胎早期，奈米銀和奈米銅對其皮膚離子細胞會產生毒性和並影響其離子調節的功能。由於斑馬魚離子細胞和人類腎臟細胞，在生理功能上和對環境變化的調節反應上都有高度的相似，故此一結果也提醒我們奈米金屬對人類的腎臟細胞可能有潛在毒性。Item 銀離子於酸性環境中對斑馬魚胚胎發育及離子調控之危害(2021) 孔耕心; Kung, Geng-Xin奈米銀在近年來被廣泛地運用於醫療及化妝品產業，其廢棄材料表面釋放出的銀離子會危害水生生物。然而，目前對於銀離子在不同酸鹼值環境中的毒性差異並不瞭解。本研究利用斑馬魚胚胎為水生生物模式，將其暴露於含有0、0.1及0.25 ppm AgNO3之pH 5或pH 7環境中，以評估銀離子毒性的差異。在暴露96小時的結果中可以得知銀離子的胚胎發育影響程度隨著濃度升高而增加。在銀離子的暴露後胚胎體長顯著下降，而卵黃囊面積則會增加。銀離子亦導致胚胎耳石囊面積及耳石面積下降，影響胚胎的內耳系統。另外，側線神經丘及毛細胞數目下降也反映出銀離子對胚胎側線的影響。值得注意的是：酸環境(pH 5)中會增加銀離子在體長、卵黃囊、耳石囊以及耳石上的影響。另一方面，銀離子降低離子細胞開口面積及數目，阻礙胚胎的離子調節功能，並且導致NaRC及HRC數目顯著降低，增加胚胎適應酸環境的困難性。另外，30分鐘及2小時的實驗中可發現：銀離子會藉由增加離子細胞的氧化壓力程度，進而誘發細胞凋亡機制。總結以上結果，本研究認為酸環境會增加銀離子對魚類的危害。Item 利用開放原始碼之深度學習軟體評估二甲基亞碸對FMR1突變斑馬魚的治療效果(2021) 歐艾瑞; Odle, Eric背景簡介：FMR1 (fragile X mental retardation 1) 基因位於人類的Xq27.3基因座，當其CGG核苷酸重複序列 (nucleotide repeat) 過長時，將會造成X-染色體脆折症 (fragile X syndrome, 簡稱 FXS)。現已開發出可用於研究FXS的斑馬魚 (Danio rerio) 突變品系，相較於囓齒類動物，斑馬魚具有快速發育、幼體透明和高繁殖力等研究優勢。前人的囓齒類動物研究發現，FMR1突變與發炎反應間存有關聯，特別是壓力條件下的細胞激素 (cytokine) 和c-Fos的表現。已知二甲基亞碸 (dimethyl sulfoxide，簡稱DMSO）為一種的消炎藥 (anti-inflammation drug)，具有多種免疫調節效果和臨床應用。 本計劃藉由建立清晰的FMR1突變行為和基因表達表型後，來探討DMSO當作治療FXS藥物的可能性。研究方法：利用顯微鏡觀察受精後 (post-fertilization, dpf) 三天大幼魚的心率和體長，以評估DMSO處理對FMR1突變品系胚胎及幼體發育的影響。採用公開性的「深度學習軟件」，進行多動物同時自發性運動跟踪法 (multi-animal locomotor tracking)，分別對幼魚進行2分鐘 (n = 10) 及對成魚進行5分鐘 (n = 5) 的記錄及分析。通過觀察幼蟲的趨態性 (thigmotaxis) 和淺水內聚性 (shoal cohesion) 來評估幼魚的數焦慮行為 (anxiety-like behavior)，並使用新型水箱潛水模式 (novel tank) 對成魚進行焦慮評估。利用C-start反射評估幼魚的學習行為通過觀察幼蟲的趨態性 (thigmotaxis) 和淺水內聚性 (shoal cohesion) 來評估幼魚的焦慮程度，並使用新型水箱潛水模式 (novel tank) 對成魚進行焦慮評估。利用C-start反射評估幼魚的非聯結型學習行為 (non-associative learning)，而成魚則採用抑制性逃避模式 (inhibitory avoidance) 來評估學習反應。並以2項選擇模式 (two choice paradigm) 來評估成魚的社會興趣反應 (social interest paradigm)。最後透過定量聚合酶連鎖反應 (quantitative PCR) 評估全腦中FMR1和細胞激素 (cytokines) 的基因表現。實驗結果：突變品系成魚的行為表型分析顯示，同型合子 (homozygotes) 出現過動的反應 (hyperactivity)，異型合子 (heterozygotes) 對陌生魚的社會興趣 (allospecific social interest) 增加，同型合子中的焦慮反應及恐懼學習(fear learning)減少。DMSO的長期投予最佳濃度為0.05％，可恢復突變品系幼魚的趨態性(thigmotaxis)和淺灘凝聚性 (shoal cohesion) 行為表型。在5-dpf時觀察到誘導的C-起始反射 (strike induced C-start) 的減少，暗示該濃度的DMSO對毛細胞可能具有潛在的毒性，然而在7-dpf的幼魚身上，並未呈現空間運動的異常。該濃度的DMSO投予能夠改善突變品系成魚的焦慮和學習缺陷等行為表型。儘管DMSO處理不能使FMR1的表現恢復到正常水平，但能顯著改善c-Fos及適度改善細胞激素因子 (IL-1β，IL-6和IL-10) 的表現。結論：本計劃的結果顯示，1）FMR1突變品系的同型合子為適合的FXS動物模型，2）DMSO的使用可減少突變品系幼魚的異常行為，3）DMSO可降低突變品系成魚的異常行為，並使其腦中發炎反應基因 (inflammation genes) 表現減少。討論：突變品系成魚的運動，焦慮和恐懼學習結果與以前的囓齒動物和斑馬魚FXS模型大致相同。但在社會興趣的結果有差異，前人報導將突變品系對同種 (cospecific) 的興趣大於同種異體 (allospecific)。在幼魚實驗中的一些新發現，包括FMR1突變體在5-dpf時明顯的非聯結型學習 (non-associative learning) 障礙，焦慮以及淺灘凝聚力的增加。過去的文獻推測的腦部發炎反應基因增加，本計劃發現FMR1 KO樣本腦中神經炎症基因被下調。進一步探討特次腦區的特異性表現 (region-specific expression)，特別是在端腦內側和外側大腦皮層 (telencephalic medial and lateral pallium) ，可能會得到與囓齒類動物一致的結果。Item 系統農藥芬普尼對斑馬魚神經系統的影響(2020) 徐代軒; Hsu, Tai-Hsuan芬普尼 (fipronil) 是一種苯基吡唑類殺蟲劑，可選擇性抑制昆蟲中的γ-氨基丁酸（GABA）受體。儘管芬普尼已成為在水生環境中使用最廣泛的藥物，但很少有研究評估芬普尼的神經毒性對於水生脊椎動物的感覺和運動系統的影響。在本碩士論文的研究中，我們選擇斑馬魚（Danio rerio）實驗動物來探討芬普尼對感覺與運動系統的神經毒理作用。我們評估了急性芬普尼暴露對斑馬魚存活率，側線毛細胞數量以及神經毒性的影響，此外，我們比較了正常與芬普尼處理下斑馬魚的游泳軌跡熱圖、速度和距離的差異。我們的實驗結果發現成年斑馬魚暴露在0.5、1.0和2.0 ppm芬普尼的水中環境24小時，與正常處理斑馬魚比較，存活率隨著芬普尼濃度顯著遞減。而斑馬魚胚胎暴露在0.1、0.5和1.0 ppm芬普尼的水中環境24小時，與正常處理斑馬魚比較，側線毛細胞數量也是隨著芬普尼濃度顯著遞減。透過組織病理學和西方墨點法研究發現，成年斑馬魚暴露於1.0 ppm芬普尼的水中環境24小時，大腦組織的氧化壓力、發炎與細胞凋亡，與正常處理斑馬魚比較，則是顯著增加。通過影像追蹤觀察，成年斑馬魚暴露在0.1和0.5 ppm芬普尼的水中環境24小時，游泳軌跡的速度和距離隨著芬普尼濃度顯著遞減，儘管芬普尼的神經毒性主要針對無脊椎動物昆蟲的GABA受體而開發，但我們的研究結果發現，芬普尼不但會減低斑馬魚的存活率，還會透過損傷側線的毛細胞數量以及產生氧化壓力、發炎與細胞凋亡來損傷大腦組織來影響斑馬魚的感覺和運動系統。這結果推論系統農藥芬普尼誘導的神經毒性會損傷水生脊椎動物的感覺與運動系統。Item 利用腦側化反轉斑馬魚探討端腦的功能(2021) 李宗祐; Li, Zong-You腦側化(cerebral lateralization)是指左右邊大腦半球(cerebral hemisphere)各會偏重執行(dominate)某些特定功能，為一種脊椎動物常見的現象。這種功能性的腦側化(functional lateralization)又可追溯至左右腦結構，或是特定分子於左右腦分佈的不對稱性(asymmetric)。許多文獻指出上丘腦(epithalamus)是探討斑馬魚腦部結構的不對稱(structural asymmetry)之重要標的。副松果體位於(parapineal)上丘腦中，正常情況下，該核團約有98%的機率會位於左腦中，僅少部分「腦反轉」個體(brain inversed)其副松果體會位於右腦。本計劃比較一般個體及腦反轉個體間，外顯行為及兩側端腦功能差異，結果將有助於了解斑馬魚腦結構不對稱性對，於腦功能側化的影響。目前已知功能性腦側化會體現於個體的認知(cognition)、情緒(emotion) 和學習與記憶(learning and memory)等面向。本研究利用腦側化反轉斑馬魚，探討整合結構不對稱性對情緒與認知的影響。本研究分別使用野生型(wild-type, WT)及foxd3:GFP品系的基因轉殖(transgenic, TG) 斑馬魚作為實驗對象，該TG品系斑馬魚的副松果體會表現外源性的綠色螢光蛋白(exogenic green fluorescence protein, GFP)，故可藉此判別副松果體位置，以篩選出正常(無反轉)的左側副松果體個體(left-side parapineal, Lpp)及腦反轉的右側副松果體個體(right-side parapineal, Rpp)個體。研究包括了四階段的行為實驗(behavioral experiment)，第一階段是基礎運動能力測試，用以確認各實驗動物的自發性游動(locomotor activity test)是否正常，基礎運動功能正常的個體，方能進入下一階段實驗。第二階段實驗為類焦慮行為(anxiety-like behavior)測試，本研究選用新穎性水箱測試(novel tank test)，交叉比對不同組別實驗動物的類焦慮行為表現。第三階段則為抑制性逃避學習測試(inhibitory avoidance test)，檢核腦反轉對恐懼記憶(fear memory)的建立是否有差異。第四階段則是利用腦反轉的TG斑馬魚，探討隨著腦構造反轉後，其功能性腦側化及偏重執行的外顯行為是否同樣出現反轉的現象。實驗結果顯示，腦反轉個體(Rpp)的運動功能與學習能力未受影響，但類焦慮行為明顯增加。在認知功能方面，對無反轉斑馬魚(Lpp)施以右側端腦破壞，會干擾空間及恐懼學習能力，故推測其與野生型斑馬魚相同，空間及恐懼的學習主要由右側端腦所主導，而腦反轉的斑馬魚(Rpp)則轉變為左側端腦主導。因而可推論斑馬魚的功能性腦側化將隨腦部發育反轉，而發生左右顛倒的情形。我們相信端腦功能性側化確實存在於斑馬魚的學習和記憶過程中，但該現象是來自於先天形生(innated)的神經迴路？或是後天經驗學習後(acquired)才逐步建立？仍有賴進一步探討。本研究也觀察到即使對端腦進行較小面績的破壞，但倘若破壞到較關鍵的部位，仍會對空間和恐懼學習造成顯著的損害。