學位論文
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Item Rh蛋白在斑馬魚胚胎皮膚的功能(2013) 施廷翰; Tin-Han ShihRh蛋白是在脊椎動物中發現的氣體通道蛋白，被認為具有運輸氨以及二氧化碳的能力。在魚類中，鰓(成魚)以及皮膚(胚胎仔魚)都是主要用來呼吸的器官，但是目前仍不確定是由何種特定細胞來執行排氨以及二氧化碳的功能，也尚未清楚Rh蛋白在其中扮演的角色。在我的研究中，我將利用斑馬魚胚胎，證明Rh蛋白參與皮膚氨以及二氧化碳運輸的功能。 在第一章的研究中，我以螢光免疫染色證明Rhcg1表現在富含氫幫浦細胞(HR cell)的頂端細胞膜上。利用SIET分析仔魚體表細胞的排氨功能後發現，HR cell比它型表皮細胞具有更強的排氨能力，而此排氨能力也隨抑制Rhcg1的表現而顯著降低。我也發現HR cell在高氨下仍可維持排氨作用，但若是抑制氫幫浦(H+-ATPase)或Rhcg1的表現則會使得HR cell失去高氨下的排氨能力，顯示H+-ATPase以及Rhcg1是HR cell執行主動排氨的關鍵分子。 我在第二章要探討排氨以及鈉離子吸收的運輸機制。透過高氨環境抑制排氨將使得鈉離子吸收能力降低。而增加鈉離子的吸收後則使排氨量增加，顯示氨與鈉離子的運輸息息相關。抑制了Rhcg1以及鈉氫交換蛋白(Na+/H+ exchanger, NHE3b)的表現後發現排氨與吸鈉量皆降低。抑制這兩蛋白也影響了體內鈉離子的含量，顯示Rhcg1以及NHE3b是魚類進行排氨依賴性的鈉離子吸收機制的重要蛋白。 於第三章我將分析另一Rh蛋白Rhbg在仔魚皮膚上的分布與功能。利用原位雜交以及免疫螢光染色我證明Rhbg表現在皮膚keratinocyte頂端與底側端的細胞膜上。與抑制Rhcg1相比，抑制了Rhbg的表現會造成更嚴重的排氨能力失調，顯示Rhbg對於排氨的影響更大。然而，Rhbg的抑制將造成Rhcg1的表現增加以及HR cell排氨能力的提升，這些現象說明補償性的排氨機制是藉由HR cell來調節。 在最後的章節中，我分析了仔魚皮膚Rh蛋白與二氧化碳運輸的相關性。研究發現利用高氨環境會抑制二氧化碳的排放，而高碳酸水也會降低氨的排放量，顯示二氧化碳與氨可能透過同一路徑排放。抑制了Rhbg蛋白會顯著降低二氧化碳排放量，但抑制Rhcg1則不會造成此現象。本實驗也利用H+探針測量表皮二氧化碳的水合(產生H+)與碳酸的水解(減少H+)，藉以分析細胞膜對於二氧化碳的通透性。在高碳酸水的浸泡實驗中，抑制Rhbg將減少體表鹼化的程度，說明較少的二氧化碳通過表皮。這些數據證實Rhbg是魚類排放二氧化碳的重要路徑。Item 應用斑馬魚作為研究端腦突觸可塑性及智能障礙疾病的模式(2012) 吳民聰; Ming-Chong Ng硬骨魚類的端腦在學習與記憶的形成過程中扮演著重要的角色，其中又以端腦背側的外側區(Dl)與中側區(Dm)最為關鍵。利用螢光追蹤方法可發現，將螢光染劑置入D1區後，螢光物質會由Dl往Dm傳遞，這現象意味著兩者之間的神經纖維有緊密相連的關係，但目前探討Dl－Dm間突觸傳遞現象的研究還非常稀少。斑馬魚是一種廣泛應用於探討藥物成癮、焦慮以及學習和記憶等研究的模式動物。本論文的研究目的之一即以電生理技術，探討在斑馬魚端腦中Dl－Dm投射路徑的神經傳遞與突觸可塑(synaptic plasticity)現象。從結果可觀察到，在Dl給予一次電刺激能引發Dm產生一個負電位之電場電位(field potential, FP)，且該FP能被AMPA/kainate受器拮抗劑CNQX、0.5 mM Ca 2+、8.0 mM Mg 2+ 及TTX (0.5 μM)所阻斷；相反的，在無Mg 2+的人工腦脊髓液以及bicuculline中FP則能被提升並引發神經的猝發(bursting)現象。以上結果意味著興奮性與抑制性的神經傳遞作用皆可能具調節神經突觸的功能。為了探究這假說，本論文進一步探討了突觸可塑現象中的長期增益效應(LTP)與長期抑制效應(LTD) 。由結果發現，連續三次高頻刺激(每秒100Hz)或投予腺苷酸環化酶啟動劑Forskolin (50 μM) 15分鐘後皆可引發LTP現象，前者為NMDA受器依賴性LTP，而後者需要extracellular related-signal kinase (ERK)的參與。此外，投予代謝型谷氨酸受體興奮劑DHPG (25 μM) 10分鐘後，則會引發持續至少１小時的LTD現象 。由此可知，斑馬魚端腦Dl與Dm間的突觸連結為端腦突觸可塑性的關鍵角色，也在探討斑馬魚學習與記憶之神經機轉上提供了一個新的電生理模式。另外，斑馬魚在發生遺傳學等相關人類疾病的研究中也已成為不可或缺的動物模式。X染色體脆折症(Fragile X syndrome, FXS)是發生率較高的人類遺傳性智能遲滯疾病，伴隨著外型異常、認知功能以及行為障礙等症狀。FXS是由於FMR1基因發生突變造成其蛋白FMRP缺失所致，建立FXS的動物模式將有助於我們進一步瞭解致病的細胞與分子機制。因此，本論文的另一研究目的即為利用FMR1基因缺失斑馬魚，探究FMRP在行為及神經突觸可塑性中所扮演的角色。實驗結果顯示，成年斑馬魚因缺乏FMR1基因表達，而產生低焦慮、過動和抑制性逃避性學習障礙現象。而在電生理上，FMRP的缺失對於突觸傳遞功能並無明顯影響，但在突觸可塑性方面，相較於對照組，FMR1剔除斑馬魚端腦LTP的強度會減弱，相反的LTD則增強。綜合此研究的各項重要發現，我們認為FMR1基因剔除斑馬魚在未來應用上，除有助於我們瞭解FXS的致病機轉外，更能協助治療性藥物的開發。Item 水通道蛋白8aa在斑馬魚仔魚上的功能性研究(2012) 高揚彥; Kao, Yang-Yen水通道蛋白(aquaporins, AQPs)是一群執行水分子通透的細胞膜蛋白。此外，有些AQPs也被發現具有二氧化碳、甘油、氨與尿素的通透性。最近研究將斑馬魚(Danio rerio) aqps基因表現於蛙卵會增加細胞膜對二氧化碳/NH3通透性。然而，目前仍沒有活體的實驗證實AQPs在動物體內參與二氧化碳(carbon dioxide, CO2)及NH3的通透能力。在本篇研究中，在原位雜交反應的結果中發現aqp8aa主要表現於斑馬魚仔魚的鰓上及皮膚上，而在利用免疫組織染色搭配原位雜交反應的結果發現AQP8AA主要在皮膚上表現於兩型的離子細胞上(HR cells and NaR cells)。而在高氨馴養(10 mM NH4+)的情況下aqp8aa的mRNA表現量有顯著提升的情況，而在高碳酸水馴養的情況下卻無此情況產生。利用反義核酸(morpholino oligonucleotides)抑制aqp8aa蛋白質的表現後，利用掃描式離子選擇性電極(scanning ion-selective technique, SIET)來分析H+及NH4+在斑馬魚仔魚皮膚及離子細胞上的運輸。在knockdown aqp8aa表現後，發現仔魚整體的H+及NH4+的排放量都有下降的情況，而在特定細胞也有相似的結果，而在CO2短暫灌流的結果中也發現魚體對於H+排放量都有下降的情況，在特定細胞也有相似的結果，由此結果推論AQP8AA在斑馬魚的仔魚上可能參與著此三物質的運輸。Item 保護劑對斑馬魚側線機械性傳導通道之影響(2012) 莊偉民; Wei-Min Chuang毛細胞的機械性傳導通道（mechanotransducer channel, MET channel）會受到機械性刺激而開啟。陽離子經由MET通道流入造成毛細胞發生去極化，而釋放神經傳遞物質。胺基糖苷類（aminogly- cosides, AGs）抗生素在臨床上被用於治療革蘭氏陰性菌感染的疾病，但是AGs常導致許多副作用包括內耳毛細胞的損傷，甚至聽力喪失。魚類側線毛細胞為一種機械性接受器，負責感覺外在水體的流動。哺乳動物內耳與魚類側線的毛細胞，兩者不論是構造形態或功能特性都有相似之處，因此斑馬魚常被採用作為耳毒性藥物篩選的模式動物。然而對於毛細胞MET通道的特性目前仍沒有很好的驗證方式。本研究應用非侵入掃描式離子選擇電極技術(scanning ion-selective electrode technique, SIET)，針對斑馬魚胚胎的MET通道進行特性分析。毛細胞的纖毛束經微電極的機械性刺激後，可記錄到鈣離子流入，但是鉀離子與鈉離子的通透並不顯著。並且鈣離子流入會被AGs（neomycin和gentamicin）的短時間（30分鐘）處理所抑制，顯示MET通道可能被AGs所阻斷。將環境中鈣離子濃度從0.2 mM提高到2 mM，可減少neomycin和gentamicin對MET通道的阻斷；而提高水中的鎂離子濃度到5 mM，卻只能降低gentamicin對MET通道的阻斷。Amiloride過去被認為是一種MET通道的阻斷劑。本研究發現amiloride並無法阻斷側線毛細胞MET通道的鈣離子流入，但卻可降低AGs對MET通道的阻斷作用。Item I. Trip6 蛋白質在小鼠腦中之表現 II. 建立人類惡性腫瘤之斑馬魚異體移植模式(2014) 楊程堯; Cheng-Yao Yang壹、 Trip6 蛋白質在小鼠腦中之表現 甲狀腺素受體作用蛋白質 6 (Thyroid receptor-interacting protein 6, Trip6)是一種焦點連接(focal adhesion)分子，它調控一些細胞機制 如：細胞之間的連接(cell adhesion)、細胞的遷移(cell migration)以及 基因轉錄的活化 (gene transactivation)。過去研究指出 Trip6 屬於幹 細胞性(stemness)的基因，在不同的幹細胞中具有較高的表現量。為了探究Trip6 在神經幹細胞所扮演的角色，我們分別檢測了 Trip6 蛋白質在胚胎與成年小鼠大腦中的表現量。發現 Trip6 的 mRNA 主要在胚胎小鼠的腦中有表現，但在成年小鼠腦中則比較低或偵測不到。其蛋白質也只可以在胚胎小鼠的大腦中被偵測到，成年小鼠則否。另外我們在胚胎與成年小鼠的大腦組織切片中，以不同的細胞標誌與 Trip6 進行組織免疫螢光染色。包括幹細胞的標誌 Sox2、增殖中細胞的標誌 Ki67、室管膜細胞的標誌 S100β、神經母細胞的標誌 DCX、神經元的標誌 MAP2、星狀細胞的標誌 GFAP 以及小膠質細胞的標誌(Iba1)。我們發現 Trip6 主要表達在胚胎小鼠的腦室區(ventricular zone, VZ)以及出生後小鼠的腦室下區(subventricular zone, SVZ)內的神經幹細胞(neural stem cells, NSC)中。這樣的結果支持Trip6 可能在調控幹細胞的特性中是一個重要的關鍵。 貳、建立人類惡性腫瘤之斑馬魚異體移植模式 神經膠質母細胞瘤是成人最常見且高侵略性的原發惡性腦腫瘤。它的侵襲力和耐傳統療法使其成為極易復發的惡性腫瘤。Rac蛋白質屬於Rho GTP酶亞家族，其主要功能包括調節細胞運動，增殖和存活。為了探究Rac蛋白質是否可以作為膠質母細胞瘤的新治療標靶，特別是對於神經膠質母細胞瘤幹細胞，我們利用其類癌幹細胞株建立了斑馬魚的異體移植模式來研究抑制Rac蛋白質對於神經膠質母細胞瘤的致癌性影響。 我們將表達控制組的shRNA或者是針對Rac蛋白質做抑制的shRNA序列和綠螢光蛋白的神經膠質母細胞瘤細胞株U251-MG和U373-MG培養於低分化培養液中，以形成腫瘤細胞球(tumorspheroids)。這些體外培養的球體細胞有著幹細胞的特性。我們將這些細胞以顯微注射的方式注射進入受精後兩天大的血管紅螢光轉基因斑馬魚Tg(kdr: mCherry)的卵黃囊。觀察發現注入的癌細胞誘導了血管新生作用的發生，而表達shRacs細胞萎縮且並未引發血管新生作用。另外，注射shRacs細胞的魚隻生存率也較高。 從我們的研究結果，Rac蛋白質會誘導膠質瘤幹細胞引發血管新生作用，並且可做為一個生物標誌。因此，Rac蛋白質可能可以進一步應用在神經膠質母細胞瘤的標靶治療上。 另一方面，我們也利用注射肝癌細胞株Hep3B進入受精後兩天大的斑馬魚卵黃囊中，來觀察Hep3B細胞的遷移現象，此模式約有20%的魚隻可觀察到細胞遷移。Item 順鉑對斑馬魚仔魚側線毛細胞和皮膚離子細胞之影響(2013) 鄒宜玲; Yi-Ling Chou摘要 Cisplatin在臨床上是最廣泛用於治療惡性腫瘤的藥物之一。然而，cisplatin常會造成的副作用包括腎毒性和耳毒性的傷害。斑馬魚已經被廣泛用來作為模式動物，研究藥物對胚胎發育以及生理功能的影響。過去研究發現cisplatin對斑馬魚側線毛細胞也會造成傷害，因此利用斑馬魚作為研究毛細胞的毒理模式。然而，目前仍未有研究利用斑馬魚去探討cisplatin的腎毒性。斑馬魚胚胎皮膚上分布數種離子細胞與哺乳動物腎臟上皮細胞有許多相似之處，因此本實驗想探討cisplatin對於斑馬魚離子細胞的影響。分析cisplatin對斑馬魚胚胎毛細胞與離子細胞的發育與功能的影響結果顯示，短時間處理濃度500 μM cisplatin 30分鐘後，顯著抑制斑馬魚胚胎側線毛細胞上的機械通道鈣離子流入，顯示毛細胞的功能受損。胚胎處理10 μM cisplatin四天後，毛細胞鈣離子流不但下降，而且毛細胞數目也顯著減少。在離子細胞的部分，處理1000 μM cisplatin 30分鐘後，會顯著降低離子細胞的排酸能力。同時離子細胞的粒腺體染色(??)性降低，顯示粒線體受到損傷。處理100 μM cisplatin 4天後，不但胚胎排酸量顯著受到抑制，也發現離子細胞數目減少。Item 利用離體電生理模式探討斑馬魚端腦雙側之功能性連結及突觸可塑性(2016) 陳郁嵐; Chen, Yu-Lan腦側化(cerebral lateralization)為一種脊椎動物常見的現象，意指大腦兩側半球各自對不同的功能扮演較優勢的角色(dominant)；腦側化對於生物個體的行為表徵扮演著重要的角色，例如人類的左右腦各負責不同類型的工作；又或是魚類會利用兩眼視覺系統，區別熟悉與陌生的環境。硬骨魚的端腦(telencephalon)被認為與學習和記憶的形成有關，特別是端腦的背外側區(dorsal lateral, Dl)及背中側區(dorsal medial, Dm)最為相關，前人利用螢光染劑DiI注射於Dl腦區後，可在Dm腦區偵測到螢光訊號，證明了Dl和Dm腦區間存在神經投射的連結。近年來，斑馬魚已成為探討學習與記憶、藥物成癮以及焦慮等行為非常重要的模式物種。從斑馬魚的胚胎發育研究以及行為觀察，已有充分的證據顯示斑馬魚腦部和哺乳類一樣，具有腦側化的現象，但關於斑馬魚端腦腦側化的研究卻非常缺乏。因此，本實驗目的為利用電生理技術探討傳遞到同側(ipsilateral)以及對側(contralateral)的Dl-Dm投射路徑的神經傳遞與突觸可塑性(synaptic plasticity)現象的異同。首先，實驗測得在單側的Dl給予電刺激，能夠在同側以及對側的Dm引發一個負電位的電場電位(negative field potential)，還可利用高頻電刺激(high frequency stimulation, HFS) 及低頻電刺激(low frequency stimulation, LFS)，分別誘發出長期增益效應(long-term potentiation, LTP)以及長期抑制效應(long-term depression, LTD) ，這兩項均為探討神經突觸可塑性的重要性指標。實驗中利用連續五次的HFS (每秒100 Hz)來誘發LTP，結果顯示在同側及對側的Dm腦區所誘發的LTP現象，此外，如預先投予NMDA受器的拮抗劑D-AP5 (30 μM)10分鐘後才進行誘發，可完全阻斷對側LTP的產生。但將D-AP5藉由灌流廓清後，則又可重新利用HFS誘發出LTP。由此證實了HFS所誘發的對側LTP，需依賴NMDA受器的活化。將左右兩側誘發的LTP實驗結果，經交叉比對分析後發現，從左側及右側的Dl給予HFS，所誘發出的同側LTP會有所差異，從右側誘發出的LTP強度會比左側誘發的小，而單從右側Dl誘發的LTP而言，其訊號強度同側會較對側的小。本實驗接着以LFS (每秒1 Hz)持續刺激20分鐘，或是投予代謝型谷氨酸受體興奮劑DHPG (40 μM) 10分鐘來誘發LTD，兩者都能誘發出至少維持一小時的LTD現象。而我們將以代謝型谷氨酸受體興奮劑DHPG所誘發的同側及對側結果比較後，我們發現對側的抑制效果較同側好。另外，Dm腦區所誘發的電場電位可以分成突觸的(synaptic, P1)以及非突觸的(non-synaptic, N2)組成，而對側Dm腦區的P1時間較同側Dm腦區的時間長，可能造成的原因為對側端腦的紀錄點較同側端腦紀錄點的距離更遠，因此有對側P1時間較同側長的現象。另外，藉由即時聚合酶鏈鎖反應(Real-time polymerase chain reaction, Real-time PCR)技術，我們發現NMDAR1a受器的mRNA在左側端腦的表現上高於右側端腦的趨勢。綜合而言，本研究的重要發現為首次觀察到斑馬魚端腦的Dl腦區和Dm腦區之間，存在著同側以及對側神經連結的突觸可塑性現象，並運用了電生理模式證明了斑馬魚端腦具有腦側化的現象。本研究成果將有助於日後為利用基因轉殖斑馬魚探討端腦腦側化分子機轉奠定基礎。Item fmr1基因剔除影響斑馬魚社會行為發育與Omega-3多元不飽和脂肪酸之治療效果(2016) 徐茂庭; Hsu, Mao-TingX染色體脆折症(fragile X syndrome, FXS)是最普遍的遺傳性智能障礙症。前人文獻指出FXS在男性及女性的好發比例分別約1/4000及1/8000，而疾病形成原因主要為在表現fmr1基因的啟動子(promoter)上具有過多的CGG重複導致fmr1基因無法正常表現蛋白質(fragile x mental retardation protein, FMRP)與其功能。FXS常見的徵狀包含學習障礙、注意力不集中、過動、焦慮、自閉行為以及社會行為異常等等。而最近斑馬魚由於純熟的基因轉殖技術以及發育學上豐富的研究成果，因此在探討人類疾病中被視為理想的模式動物。而在我們實驗室先前的研究發現fmr1基因剔除斑馬魚會有許多不正常的行為表現，像是過動、不正常的焦慮表現以及恐懼記憶受損。此外，在先前的研究也指出fmr1基因與社會行為的發育有相關。為了探究此議題，我們應用群游行為、群游偏好行為、自發性空間探索行為以及焦慮行為進行相關實驗。此外，我們也利用不飽和脂肪酸的補充來探究其對於在fmr1基因剔除斑馬魚異常行為表現之治療效果。 而我們先前研究發現fmr1基因剔除斑馬魚會有群游偏好行為提早發育的現象，並且其現象與焦慮行為有相關，但在此研究中並沒有針對單純同種魚群以及異種魚群的群游進行研究探討。以外，我們繼續探討此群游行為的差異並利用另一種焦慮行為分析方法(novel tank task)探討兩者的相關性。而結果顯示不論在野生型以及fmr1基因剔除斑馬魚，群游行為會在受精後14天形成，並在基因剔除的動物中的群游程度會比正常野生型來得高。此外，研究也發現基因剔除隻斑馬魚在受精後28天會有過動以及焦慮異常的現象，這些結果指出群游行為的差異與過動及焦慮異常有相關。 另一方面，我們也想探討ω-3不飽和脂肪酸(n-3 polyunsaturated fatty acids, n-3 PUFAs)對於fmr1基因剔除斑馬魚行為異常之治療效果，因為在其中的二十二碳六烯酸(docosahexaenic acid, DHA)以及二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid, EPA)屬於必需的養分，而文獻指出補充DHA以及EPA可以降低過早死亡的風險以及提升心智能力。此外，在給予ω-3不飽和脂肪酸補充後可降低異常行為的發生，其中包含社會行為異常、自閉以及注意力缺陷。而近期的報告指出在fmr1基因剔除小鼠補充ω-3不飽和脂肪酸可以治療異常的行為，例如：情緒變化、社會互動以及非空間性的記憶能力。在我們的研究中，基因剔除斑馬魚端腦中的grin1b表現量顯著的下降，而htr2a以及htr2cl1兩者表現量顯著的提升。而透過氣相色譜法-質譜法聯用分析全魚的脂肪酸比例，發現基因剔除斑馬魚的不飽和脂肪酸比一般野生型低。此外，我們也發現ω-3不飽和脂肪酸的補充可以治療其行為異常，像是不正常的焦慮表現以及恐懼記憶受損。然而，在肝臟中的ω-3不飽和脂肪酸合成相關酵素的基因表現量沒有顯著的差異。統整以上結果，基因剔除斑馬魚之行為異常可能跟不飽和脂肪酸比例較低有關，以及ω-3不飽和脂肪酸補充對於X染色體脆折症是一種具有潛力的治療方法。