學位論文
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Item 探討三氟敏 (Trifloxystrobin) 對斑馬魚胚胎離子調節、循環系統和感覺行為之影響(2024) 高悅慈; Kao, Yueh-Tzu三氟敏是一種被廣泛使用的甲氧基丙烯酸酯類除真菌劑。在三氟敏的過度使用下，已有研究證明其在環境中的殘留及對水生生物的風險。為了全面了解三氟敏對非目標生物的毒性作用及機制，本研究選擇斑馬魚作為實驗動物，探討其對胚胎之致死性、離子調節功能、感覺系統、循環系統及基因表達的影響。實驗將受精後4小時的胚胎暴露於0、100、200和300 ppb的三氟敏溶液中，持續96或120小時。結果顯示，濃度高於200 ppb會降低胚胎存活率和孵化率。同時，離子細胞數量及胚胎體內的Na+、K+和Ca2+水平顯著減少，表明其對離子調節功能產生了負面影響。在循環系統，除了圍心腔水腫、和心率降低，還造成了心室收縮力增加、心室血液逆流和血流流速變慢等心血管損傷。此外，本研究還揭示了三氟敏的感覺系統毒性，其不僅導致側線毛細胞數量減少，眼睛、耳石和耳石囊變小，通過行為反應實驗，還證實了側線感覺、聽覺、視覺和嗅覺功能亦受到損害。綜上所述，本研究闡明了三氟敏對斑馬魚胚胎的多種毒性作用，並透過RNA定序，從基因層面對其可能機制進行探討。Item 聚苯乙烯奈米塑膠對斑馬魚 (Danio rerio) 胚胎的影響(2022) 甘富信; Kantha, Phunsin塑料是日常生活中使用最廣泛的材料，疏忽的垃圾管理導致環境中的數量不斷增加。值得注意的是，納米塑料（NPs; 直徑從 5 到 100 納米的微小塑料碎片）難以追踪，並已成為 21 世紀的主要污染源。聚苯乙烯 (PS) 是環境中最普遍的納米塑料之一。在實驗室中，PS-NPs 已被證明可以穿透皮膚並積聚在魚胚胎的器官中。然而，人們對 PS-NPs 對魚胚胎皮膚功能（如離子調節和側線感覺）的潛在影響知之甚少。在本研究中，斑馬魚胚胎被用作動物模型來探索 PS-NPs 可能對魚胚胎造成的毒性作用。在本研究的第一部分，斑馬魚胚胎暴露於三種不同大小的 PS-NP（25、75 和 200 nm）中 96 小時或 120 小時。分析了幾類毒性終點，包括發育形態（體長、身體彎曲、體節長度、眼睛大小、心包腔大小和卵黃囊大小）、身體活動（運動活動、視運動反應和強硬誘發反應）和側線感覺（毛細胞數量和形態）。此外，還檢測了神經標記基因（ache、syn2a 和 mbp）和眼睛發育基因(pax6a, pax6b, otx2, 和 rx1)的 mRNA 表達。結果表明，50 mg/L 的 25 nm PS-NPs 在所有的毒性終點均引起顯著的不良反應，表明胚胎發育遲緩和異常，身體活動和感覺毛細胞也顯著受損。在 25 mg/L 的 25 nm PS-NPs 下，只有身體活動和毛細胞顯著受損。在 10 mg/L 的 25 nm PS-NPs 和 75 和 200 nm PS-NPs 的所有濃度下，大多數毒性終點的影響是不顯著的。在本研究的第二部分，斑馬魚胚胎暴露於 25 nm PS-NPs 96 小時，以測試 PS-NPs 對皮膚細胞（離子細胞和角質細胞）離子調節功能的影響。暴露於50 mg/L PS-NPs後，胚胎皮膚細胞的離子（Na+、K+和Ca2+）含量和酸/氨排泄量顯著下降。皮膚角質形成細胞的頂端結構在 10、25 和 50 mg/L 時受損。離子細胞的數量和線粒體活性在 25 和 50 mg/L 時降低。 CellROX 染色顯示的活性氧 (ROS) 水平顯示離子細胞和角質形成細胞都處於氧化壓力狀態。 PS-NPs 降低了抗氧化基因（sod1、sod2、cat 和 gpx1a）的 mRNA 表達，並促進了細胞凋亡相關基因（casp3a）。綜上所述，本研究表明 PS-NPs 可能抑制抗氧化反應並誘導氧化應激，導致線粒體損傷和離子細胞死亡，最終損害皮膚功能，包括離子攝取、pH 調節和氨排泄。本研究揭示了 PS-NPs 可能對魚胚胎造成的潛在風險以及 PS-NPs 可能從分子和細胞到個體水平的毒理學機制。Item 利用斑馬魚胚胎模式研究烯酸酯類殺菌劑pyraclostrobin 之毒性(2023) 葉凡瑄; Yeh, Fan-Hsuan百克敏(pyraclostrobin)是一種被大量使用的農業除真菌劑，透過地表徑流等途徑汙染環境，在世界各地的水域已被檢出。其對於水生生物包括魚類以及兩棲類，具有極高的非專一毒性。先前研究證實百克敏對於斑馬魚具有粒線體毒性、心毒性並造成發育延遲、增加氧化壓力、降低活動力。但對魚類其他生理功能的影響仍不清楚。本研究利用斑馬魚胚胎作爲毒理模式，將其曝露於100-1000 ppb的百克敏96小時後，觀察其對於基因表現、離子調節、側線感覺功能的變化；曝露百克敏120小時後，觀察聽覺與視覺行爲的改變。並利用轉基因螢光魚觀察中樞神經系統的影響。結果顯示百克敏96小時半致死濃度為204.6 ppb。濃度≥100 ppb 造成心率下降、側線毛細胞損傷、觸碰逃跑速度下降；濃度≥150 ppb造成體長降低，眼睛、耳石囊、耳石面積變小，卵黃消耗減少，體内Ca2+、K+離子含量下降，離子細胞數目減少；濃度200 ppb造成圍心腔水腫、皮膚幹細胞減少以及側線毛細胞減少。利用RNA定序分析基因表現發現許多異常包括:離子調節(atp1a1a, atp2b,atp6v, kcnj1a, rhcg)、側線感覺(cib2, myo6b, s100)、粒線體電子傳遞鏈(cytb, cox3、cox19)、內耳感覺(otomp, cep290, oc90)、視覺(cabp5a, clcc1)、細胞凋亡(casp3, casp8, casp17)等相關基因。在行為實驗發現，百克敏會降低聲音驚嚇反應之敏感度，並延長視覺運動反應時間。螢光魚的結果顯示，百克敏會造成脊髓運動神經元減少。綜上所述，本研究提出百克敏可能會造成魚類離子調節、周邊感覺(側線、視覺、聽覺)以及中樞神經異常，對魚類生存造成威脅，需更審慎評估百克敏的使用。Item 芬普尼及酸性水的暴露對於斑馬魚胚胎發育及離子調節之影響(2022) 彭元廷; Peng, Yuan-Ting人類活動引發的淡水酸化已成為全球性的問題，並且已對水生動物構成嚴重的威脅，而酸性水可能會增加水中污染物對水生動物的毒性。芬普尼 (fipronil)是一種苯基吡唑類殺蟲劑，目前廣泛使用於農業活動和寵物用藥。先前的研究表明，芬普尼的殘留物會對魚類造成多種毒性作用。然而，目前尚不清楚芬普尼是否會損害魚類的離子調節及酸化水是否會增強芬普尼的毒性。在這項研究中，斑馬魚胚胎被當成模式動物來回答這些問題。從受精後 4 小時開始，斑馬魚胚胎暴露在不同濃度 (0、0.1、0.5、1、5 和 10 ppm)的芬普尼中 96 小時。芬普尼以劑量依賴性的方式增加死亡率並延遲孵化。 芬普尼 (≧ 1 ppm) 的毒性亦使得身體及肌節的長度、眼睛、耳石囊和嗅窩的面積都與控制組相比呈現下降。此外，芬普尼還降低了側線毛細胞及皮膚離子細胞 (包括 HR 細胞和 NaR 細胞)的數量以及相關的離子調節功能。在酸性水 (pH5) 中，芬普尼導致離子細胞酸分泌的功能更嚴重地下降。這項研究首次表明芬普尼可以損傷皮膚離子細胞並威脅魚類在酸性環境中的生存。Item 氨暴露導致斑馬魚胚胎離子調節損傷及成魚行為改變(2021) 鄭倢安; Cheng, Chieh-An氨（包含氣態的NH3以及離子態的NH4+）為魚類代謝胺基酸後產生的主要含氮廢物，也是常見的環境汙染物。當魚體內氨濃度提高，將會導致魚隻中樞神經受損，抽搐、昏迷甚至死亡。然而，目前研究中多著重在高氨處理後魚類的適應機制，關於氨對魚隻離子調節功能及行為的毒性作用尚不清楚。本研究分為兩個部分，首先利用斑馬魚胚胎作為模式動物，探討氨如何對胚胎離子調節功能造成損傷，接著利用斑馬魚成魚作為模式動物，評估氨處理後斑馬魚的行為改變。在胚胎毒性研究中，浸泡於不同濃度（0、10、15、20 mM）的氯化銨溶液中96小時（4-100 hpf）後，觀察胚胎卵黃囊上離子細胞及表皮角質細胞。結果指出，20 mM氨處理後離子細胞內氧化壓力上升（CellROX螢光亮度顯著上升）且由Rhodamine 123標定的具粒線體活性離子細胞數目顯著下降，顯示粒線體活性降低。此外，以細胞免疫螢光染色標定20 mM氨處理後凋亡細胞數目顯著上升，並觀察到表皮角質細胞結構損傷。綜合以上結果發現，在高氨處理下，斑馬魚胚胎離子細胞及表皮角質細胞損傷，導致斑馬魚胚胎失去體表屏障，體內離子大量流失。而在行為實驗中，將斑馬魚浸泡於不同濃度（0、1、5、10 mM）的氯化銨溶液中4小時後，對游泳行為、社交行為、學習與記憶能力等面向進行不同實驗。結果顯示1 mM氨處理時可以促進學習記憶能力；5 mM時焦慮及恐懼程度提升且群游下降；10 mM氨處理時活動力、社交行為及焦慮程度下降，但恐懼程度上升。綜上所述，在不同濃度氨暴露以及不同的環境刺激下，斑馬魚的游泳、社交、學習等行為改變，而這些改變可能使斑馬魚存活率下降，進一步使個體適存度降低。Item 順鉑導致斑馬魚胚胎離子細胞氧化壓力與細胞凋亡(2020) 吳巧羚; Wu, Ciao-Ling順鉑為現今廣泛使用之化療藥物，卻伴隨腎毒性、神經毒性和耳毒性等副作用，其中主要限制施予劑量的因素為腎毒性。順鉑可經由銅離子運輸蛋白與有機陽離子運輸蛋白進入腎臟上皮細胞，造成腎小管損傷，目前哺乳動物細胞研究模式已知氧化壓力生成是順鉑造成細胞損傷的主要原因之一。斑馬魚是廣泛使用於毒理學研究與藥物測試的模式動物，其仔魚表皮分布的五型離子細胞與哺乳動物腎臟上皮細胞有許多相似之處，因直接暴露於環境，好操作且易觀察。本研究以斑馬魚仔魚表皮離子細胞作為研究順鉑腎毒性之工具，使用活體螢光染色觀察順鉑對離子細胞的影響，來證實順鉑會導致離子細胞氧化壓力生成、粒線體損傷和細胞凋亡。本實驗將斑馬魚胚胎浸泡於不同濃度的順鉑（0、50、100、300、500 或 1000 μM）進行長時間（4-100 hpf）或短時間（96-98 hpf）處理，再使用活體螢光染劑單染或共染的方式，標定斑馬魚仔魚卵黃囊上具粒線體活性離子細胞（Rhodamine 123/MitoTracker）與凋亡細胞（AcridineOrange），並探討當中活性氧化物的產生（CellROX/ MitoSOX）。斑馬魚胚胎分別在順鉑處理 96小時及 2 小時後，Rhodamine 123 標定具粒線體活性離子細胞數目均顯著下降，且凋亡細胞數目顯著上升；斑馬魚胚胎分別在順鉑處理 96 小時及 1 小時後，產生活性氧化物的離子細胞數目或 CellROX/MitoSOX 的螢光亮度均顯著上升。此外，將斑馬魚胚胎進行抗氧化劑 NAC（0、100、300、500 或 1000 μM）與順鉑的長時間共處理，發現 NAC 能降低胚胎的死亡率，並減緩順鉑對離子細胞所導致的氧化壓力與損害。由以上結果可證實順鉑會導致離子細胞氧化壓力生成和粒線體損傷，並引起細胞凋亡，而抗氧化劑 NAC 可作為順鉑毒性的保護劑。