學位論文

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Subject: search.filters.subject.斑馬魚Start date: 2016End date: 2016

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    利用離體電生理模式探討斑馬魚端腦雙側之功能性連結及突觸可塑性
    (2016) 陳郁嵐; Chen, Yu-Lan
    腦側化(cerebral lateralization)為一種脊椎動物常見的現象，意指大腦兩側半球各自對不同的功能扮演較優勢的角色(dominant)；腦側化對於生物個體的行為表徵扮演著重要的角色，例如人類的左右腦各負責不同類型的工作；又或是魚類會利用兩眼視覺系統，區別熟悉與陌生的環境。硬骨魚的端腦(telencephalon)被認為與學習和記憶的形成有關，特別是端腦的背外側區(dorsal lateral, Dl)及背中側區(dorsal medial, Dm)最為相關，前人利用螢光染劑DiI注射於Dl腦區後，可在Dm腦區偵測到螢光訊號，證明了Dl和Dm腦區間存在神經投射的連結。近年來，斑馬魚已成為探討學習與記憶、藥物成癮以及焦慮等行為非常重要的模式物種。從斑馬魚的胚胎發育研究以及行為觀察，已有充分的證據顯示斑馬魚腦部和哺乳類一樣，具有腦側化的現象，但關於斑馬魚端腦腦側化的研究卻非常缺乏。因此，本實驗目的為利用電生理技術探討傳遞到同側(ipsilateral)以及對側(contralateral)的Dl-Dm投射路徑的神經傳遞與突觸可塑性(synaptic plasticity)現象的異同。首先，實驗測得在單側的Dl給予電刺激，能夠在同側以及對側的Dm引發一個負電位的電場電位(negative field potential)，還可利用高頻電刺激(high frequency stimulation, HFS) 及低頻電刺激(low frequency stimulation, LFS)，分別誘發出長期增益效應(long-term potentiation, LTP)以及長期抑制效應(long-term depression, LTD) ，這兩項均為探討神經突觸可塑性的重要性指標。實驗中利用連續五次的HFS (每秒100 Hz)來誘發LTP，結果顯示在同側及對側的Dm腦區所誘發的LTP現象，此外，如預先投予NMDA受器的拮抗劑D-AP5 (30 μM)10分鐘後才進行誘發，可完全阻斷對側LTP的產生。但將D-AP5藉由灌流廓清後，則又可重新利用HFS誘發出LTP。由此證實了HFS所誘發的對側LTP，需依賴NMDA受器的活化。將左右兩側誘發的LTP實驗結果，經交叉比對分析後發現，從左側及右側的Dl給予HFS，所誘發出的同側LTP會有所差異，從右側誘發出的LTP強度會比左側誘發的小，而單從右側Dl誘發的LTP而言，其訊號強度同側會較對側的小。本實驗接着以LFS (每秒1 Hz)持續刺激20分鐘，或是投予代謝型谷氨酸受體興奮劑DHPG (40 μM) 10分鐘來誘發LTD，兩者都能誘發出至少維持一小時的LTD現象。而我們將以代謝型谷氨酸受體興奮劑DHPG所誘發的同側及對側結果比較後，我們發現對側的抑制效果較同側好。另外，Dm腦區所誘發的電場電位可以分成突觸的(synaptic, P1)以及非突觸的(non-synaptic, N2)組成，而對側Dm腦區的P1時間較同側Dm腦區的時間長，可能造成的原因為對側端腦的紀錄點較同側端腦紀錄點的距離更遠，因此有對側P1時間較同側長的現象。另外，藉由即時聚合酶鏈鎖反應(Real-time polymerase chain reaction, Real-time PCR)技術，我們發現NMDAR1a受器的mRNA在左側端腦的表現上高於右側端腦的趨勢。綜合而言，本研究的重要發現為首次觀察到斑馬魚端腦的Dl腦區和Dm腦區之間，存在著同側以及對側神經連結的突觸可塑性現象，並運用了電生理模式證明了斑馬魚端腦具有腦側化的現象。本研究成果將有助於日後為利用基因轉殖斑馬魚探討端腦腦側化分子機轉奠定基礎。
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    fmr1基因剔除影響斑馬魚社會行為發育與Omega-3多元不飽和脂肪酸之治療效果
    (2016) 徐茂庭; Hsu, Mao-Ting
    X染色體脆折症(fragile X syndrome, FXS)是最普遍的遺傳性智能障礙症。前人文獻指出FXS在男性及女性的好發比例分別約1/4000及1/8000，而疾病形成原因主要為在表現fmr1基因的啟動子(promoter)上具有過多的CGG重複導致fmr1基因無法正常表現蛋白質(fragile x mental retardation protein, FMRP)與其功能。FXS常見的徵狀包含學習障礙、注意力不集中、過動、焦慮、自閉行為以及社會行為異常等等。而最近斑馬魚由於純熟的基因轉殖技術以及發育學上豐富的研究成果，因此在探討人類疾病中被視為理想的模式動物。而在我們實驗室先前的研究發現fmr1基因剔除斑馬魚會有許多不正常的行為表現，像是過動、不正常的焦慮表現以及恐懼記憶受損。此外，在先前的研究也指出fmr1基因與社會行為的發育有相關。為了探究此議題，我們應用群游行為、群游偏好行為、自發性空間探索行為以及焦慮行為進行相關實驗。此外，我們也利用不飽和脂肪酸的補充來探究其對於在fmr1基因剔除斑馬魚異常行為表現之治療效果。 而我們先前研究發現fmr1基因剔除斑馬魚會有群游偏好行為提早發育的現象，並且其現象與焦慮行為有相關，但在此研究中並沒有針對單純同種魚群以及異種魚群的群游進行研究探討。以外，我們繼續探討此群游行為的差異並利用另一種焦慮行為分析方法(novel tank task)探討兩者的相關性。而結果顯示不論在野生型以及fmr1基因剔除斑馬魚，群游行為會在受精後14天形成，並在基因剔除的動物中的群游程度會比正常野生型來得高。此外，研究也發現基因剔除隻斑馬魚在受精後28天會有過動以及焦慮異常的現象，這些結果指出群游行為的差異與過動及焦慮異常有相關。 另一方面，我們也想探討ω-3不飽和脂肪酸(n-3 polyunsaturated fatty acids, n-3 PUFAs)對於fmr1基因剔除斑馬魚行為異常之治療效果，因為在其中的二十二碳六烯酸(docosahexaenic acid, DHA)以及二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid, EPA)屬於必需的養分，而文獻指出補充DHA以及EPA可以降低過早死亡的風險以及提升心智能力。此外，在給予ω-3不飽和脂肪酸補充後可降低異常行為的發生，其中包含社會行為異常、自閉以及注意力缺陷。而近期的報告指出在fmr1基因剔除小鼠補充ω-3不飽和脂肪酸可以治療異常的行為，例如：情緒變化、社會互動以及非空間性的記憶能力。在我們的研究中，基因剔除斑馬魚端腦中的grin1b表現量顯著的下降，而htr2a以及htr2cl1兩者表現量顯著的提升。而透過氣相色譜法-質譜法聯用分析全魚的脂肪酸比例，發現基因剔除斑馬魚的不飽和脂肪酸比一般野生型低。此外，我們也發現ω-3不飽和脂肪酸的補充可以治療其行為異常，像是不正常的焦慮表現以及恐懼記憶受損。然而，在肝臟中的ω-3不飽和脂肪酸合成相關酵素的基因表現量沒有顯著的差異。統整以上結果，基因剔除斑馬魚之行為異常可能跟不飽和脂肪酸比例較低有關，以及ω-3不飽和脂肪酸補充對於X染色體脆折症是一種具有潛力的治療方法。