學位論文
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Item 水通道蛋白8aa在斑馬魚仔魚上的功能性研究(2012) 高揚彥; Kao, Yang-Yen水通道蛋白(aquaporins, AQPs)是一群執行水分子通透的細胞膜蛋白。此外，有些AQPs也被發現具有二氧化碳、甘油、氨與尿素的通透性。最近研究將斑馬魚(Danio rerio) aqps基因表現於蛙卵會增加細胞膜對二氧化碳/NH3通透性。然而，目前仍沒有活體的實驗證實AQPs在動物體內參與二氧化碳(carbon dioxide, CO2)及NH3的通透能力。在本篇研究中，在原位雜交反應的結果中發現aqp8aa主要表現於斑馬魚仔魚的鰓上及皮膚上，而在利用免疫組織染色搭配原位雜交反應的結果發現AQP8AA主要在皮膚上表現於兩型的離子細胞上(HR cells and NaR cells)。而在高氨馴養(10 mM NH4+)的情況下aqp8aa的mRNA表現量有顯著提升的情況，而在高碳酸水馴養的情況下卻無此情況產生。利用反義核酸(morpholino oligonucleotides)抑制aqp8aa蛋白質的表現後，利用掃描式離子選擇性電極(scanning ion-selective technique, SIET)來分析H+及NH4+在斑馬魚仔魚皮膚及離子細胞上的運輸。在knockdown aqp8aa表現後，發現仔魚整體的H+及NH4+的排放量都有下降的情況，而在特定細胞也有相似的結果，而在CO2短暫灌流的結果中也發現魚體對於H+排放量都有下降的情況，在特定細胞也有相似的結果，由此結果推論AQP8AA在斑馬魚的仔魚上可能參與著此三物質的運輸。Item 保護劑對斑馬魚側線機械性傳導通道之影響(2012) 莊偉民; Wei-Min Chuang毛細胞的機械性傳導通道（mechanotransducer channel, MET channel）會受到機械性刺激而開啟。陽離子經由MET通道流入造成毛細胞發生去極化，而釋放神經傳遞物質。胺基糖苷類（aminogly- cosides, AGs）抗生素在臨床上被用於治療革蘭氏陰性菌感染的疾病，但是AGs常導致許多副作用包括內耳毛細胞的損傷，甚至聽力喪失。魚類側線毛細胞為一種機械性接受器，負責感覺外在水體的流動。哺乳動物內耳與魚類側線的毛細胞，兩者不論是構造形態或功能特性都有相似之處，因此斑馬魚常被採用作為耳毒性藥物篩選的模式動物。然而對於毛細胞MET通道的特性目前仍沒有很好的驗證方式。本研究應用非侵入掃描式離子選擇電極技術(scanning ion-selective electrode technique, SIET)，針對斑馬魚胚胎的MET通道進行特性分析。毛細胞的纖毛束經微電極的機械性刺激後，可記錄到鈣離子流入，但是鉀離子與鈉離子的通透並不顯著。並且鈣離子流入會被AGs（neomycin和gentamicin）的短時間（30分鐘）處理所抑制，顯示MET通道可能被AGs所阻斷。將環境中鈣離子濃度從0.2 mM提高到2 mM，可減少neomycin和gentamicin對MET通道的阻斷；而提高水中的鎂離子濃度到5 mM，卻只能降低gentamicin對MET通道的阻斷。Amiloride過去被認為是一種MET通道的阻斷劑。本研究發現amiloride並無法阻斷側線毛細胞MET通道的鈣離子流入，但卻可降低AGs對MET通道的阻斷作用。Item 水通道蛋白(aqp1a)在斑馬魚胚胎表皮參與二氧化碳的運送(2011) 趙珮伶; Pei-lin Chao水通道蛋白(aquaporins, AQPs)是一群執行水分子通透的細胞膜蛋白。此外，有些AQPs也被發現具有二氧化碳、甘油、氨與尿素的通透性。因此AQPs 依其功能又區分成三亞群，分別為aquaporins, aquaammoniaporins, 與 aquaglyceroporins三群。在哺乳類研究發現，AQP1缺失的紅血球會降低二氧化碳通透性。最近研究將斑馬魚(Danio rerio) aqp1a表現於蛙卵會增加細胞膜對二氧化碳通透性。然而，目前仍沒有活體的實驗證實AQPs在動物體內參與二氧化碳(carbon dioxide, CO2)通透。本研究利用斑馬魚仔魚為模式動物，探討aqp1a在仔魚表皮細胞上的分佈與功能。將1 % CO2馴養一週的仔魚以real-time PCR分析，結果顯示aqp1a mRNA表現量增加。利用原位雜交與抗體染色標定，發現aqp1a大量表現於卵黃囊表皮上的H+-pump-rich cell與Na+ -pump-rich cell，其他表皮細胞則有少量的表現。利用morpholino knockdown弱化aqp1a蛋白的表現再利用離子選擇電極技術(SIET)分析碳酸排放，發現aqp1a基因弱化的仔魚碳酸的排放減少，顯示aqp1a在胚胎體表細胞扮演CO2通透的功能。Item 順鉑對斑馬魚仔魚側線毛細胞和皮膚離子細胞之影響(2013) 鄒宜玲; Yi-Ling Chou摘要 Cisplatin在臨床上是最廣泛用於治療惡性腫瘤的藥物之一。然而，cisplatin常會造成的副作用包括腎毒性和耳毒性的傷害。斑馬魚已經被廣泛用來作為模式動物，研究藥物對胚胎發育以及生理功能的影響。過去研究發現cisplatin對斑馬魚側線毛細胞也會造成傷害，因此利用斑馬魚作為研究毛細胞的毒理模式。然而，目前仍未有研究利用斑馬魚去探討cisplatin的腎毒性。斑馬魚胚胎皮膚上分布數種離子細胞與哺乳動物腎臟上皮細胞有許多相似之處，因此本實驗想探討cisplatin對於斑馬魚離子細胞的影響。分析cisplatin對斑馬魚胚胎毛細胞與離子細胞的發育與功能的影響結果顯示，短時間處理濃度500 μM cisplatin 30分鐘後，顯著抑制斑馬魚胚胎側線毛細胞上的機械通道鈣離子流入，顯示毛細胞的功能受損。胚胎處理10 μM cisplatin四天後，毛細胞鈣離子流不但下降，而且毛細胞數目也顯著減少。在離子細胞的部分，處理1000 μM cisplatin 30分鐘後，會顯著降低離子細胞的排酸能力。同時離子細胞的粒腺體染色(??)性降低，顯示粒線體受到損傷。處理100 μM cisplatin 4天後，不但胚胎排酸量顯著受到抑制，也發現離子細胞數目減少。Item 以斑馬魚模式進行腦功能側化相關研究(2017) 吳曜如; Wu, Yao-Ju斑馬魚(Denio rerio)因其胚胎透明、容易飼養及觀察等優點，近年成為神經與發育生物學研究之新興動物模式。斑馬魚的神經系統與大多數硬骨魚類似，其端腦 (telencephalon) 的主要構造、相對體積大小、解剖位置及功能與哺乳類之邊緣系統 (limbic system) 相似，為一個易於操作的端腦功能研究模式。本篇論文即利用斑馬魚的各項研究優勢，進行三個部分的研究，以探討斑馬魚端腦的功能、相關之運作過程與訊息傳遞之機轉。在第一章中，我們延續先前的實驗成果，利用吸引法(aspiration)對端腦進行直接的破壞，以探究端腦在空間記憶形成上所扮演的角色，結果顯示端腦的左、右兩半球，分別對於空間及情緒性記憶 (emotional memory) 有著不同的影響，特別是在獲取 (acquisition) 及重新擷取 (retrieval) 的過程中，而對端腦進行單側破壞(unilateral ablation)，均可干擾情緒性記憶的形成。在第二章中，由於過去文獻發現X染色體脆折症 (fragile X syndrome) 患者在腦側化 (cerebral lateralization) 的表現上受到影響，故藉著fmr1基因剔除品系斑馬魚，探討此斑馬魚身上，是否會呈現類似人類病患之異常情緒性行為，結果證實了fmr1之缺損，會造成斑馬魚情緒性行為之發展異常，也會干擾了抑制性逃避記憶 (inhibitory avoidance memory) 的形成。在第三章中，主要使用了電生理的實驗方式，探究斑馬魚端腦外側 (Dl) 到端腦內側 (Dm) 之訊號傳遞。我們發現不只通往同側的端腦內側 (ipsilateral telencephalic Dm region) 有訊號傳遞，而在對側 (contralateral) 端腦之內側亦有類似的訊號傳遞，並且兩側同時存在着代表神經可塑性的長期增强效應long-term potentiation (LTP) 及長期抑制效應long-term depression (LTD) 現象，兩者的作用機制需要麩胺酸NMDA及代謝性受體 (metabotropic glutamate receptor) 的參與；其神經可塑性之LTP與LTD模式，在左、右側端腦中的表現並非完全相同，這呼應了第一階段的實驗結果，進一步證實了斑馬魚的左右側端腦，在處理學習與記憶的功能時，扮演著不同的角色。最後我們也發現，有別於哺乳類動物，斑馬魚主要藉由前連合 (anterior commissure) 構造進行兩側端腦的訊息傳遞。 總結上述三階段的研究成果，可證明斑馬魚端腦中亦存在著腦側化的現象，而斑馬魚確實能應用於探討腦側化的機轉研究。Item 前列腺素E2在斑馬魚酸鹼調節之功能(2018) 彭彥松; Peng, Yan-Sung前列腺素E2(Prostaglandin E2)對於魚類酸鹼平衡的調節仍是未知的。PGE2可透過四型受體(EP)，進而影響不同的生理功能。哺乳類主要利用腎臟維持酸鹼平衡，曾有研究發現PGE2參與兔子集尿管的排酸機制，而兩生類也需要透過表皮組織進行酸鹼平衡，排酸能力會受到不同的PGE2濃度而有所改變。然而，生活在水中的魚類，所需要面對環境改變的壓力比起前兩者更大，為了解PGE2與魚類酸鹼調節之間的關係，本研究將斑馬魚進行七天酸處理後發現鰓上PGE2相關的基因表現量上升。此外，將PGE2合成酵素弱化後，排酸能力、HR細胞數量以及排酸相關蛋白質的基因表現量上升。而將受體的基因ptger1a或ptger1b弱化後，在酸性環境下，可能藉由降低碳酸酐酶(ca2)基因表現量進而導致排酸能力無法上升。由此可知，PGE2可能參與斑馬魚的排酸機制，且在正常環境中的運作機制與酸性環境可能不同。Item N-乙醯半胱氨酸對斑馬魚仔魚側線毛細胞的影響(2019) 馮瑩茜; Phong, Ying-ChiannN-乙醯半胱氨酸（N-acetyl cysteine，NAC）是一種作為營養食品的抗氧化劑。在水產養殖上使用N-乙醯半胱氨酸餵食吳郭魚亦可以降低微囊藻毒素和柱孢藻毒素所產生的氧化壓力。此研究的目的是想要探討抗氧化劑NAC的潛在毒性及致死劑量，以便未來在魚類上作為抗氧化劑的應用。此外測試NAC對於新黴素所造成耳毒性傷害是否有保護作用。我們將斑馬魚長時間及短時間曝露於NAC，並觀察NAC對斑馬魚的影響。我們的研究結果顯示NAC會對斑馬魚仔魚造成死亡的現象，並且其藥效與濃度成正相關。另外，NAC對各個發育的指標都會帶來負面的影響，如存活率、孵化率、斑馬魚仔魚的體長及心跳速率。另外，使用FM1-43這活體染劑，可得知NAC在急性或是慢性處理下都會減少斑馬魚仔魚的毛細胞。急性NAC處理後會增加毛細胞的氧化壓力。除此之外，NAC亦會減少斑馬魚仔魚卵黃囊上的離子細胞密度。從以上的結果可得知不管是急性或是慢性的NAC處理都會對斑馬魚造成毒性傷害。Item 以顯微影像分析技術測量奈米銀與奈米銅對斑馬魚心血管功能之影響(2018) 于清華; Yu, Ching-Hua奈米材料由於其特性有別於原本的大分子型態，自二十世紀發現後至今已被廣泛用於工業上，如作為殺菌介質的奈米銀，以及用於生物、電化學感應器的奈米銅。然而，對於這些奈米材料可能帶來的環境汙染與對生物體的危害，仍缺乏完整的認識。本研究以斑馬魚的胚胎作為動物模式觀察奈米銀、奈米銅粒子的毒性。在浸泡處理四天後，觀察胚胎的死亡率、孵育率、體長的影響，並透過我們發展的高格數與高畫質顯微攝影技術，測量胚胎心血管功能的受損情形。實驗結果發現，奈米銀與奈米銅在3 ppm就會對上述生理指標有顯著的危害。在心血管功能測量上，發現奈米銀在1 ppm就會導致心輸出量的下降，而3 ppm處理會更進一步地影響心室的收縮力與心率；奈米銅則在0.1 ppm的濃度下就會引發心室體積的減少，在3 ppm處理下還會造成收縮力的下降，而這些奈米金屬引發的心室功能的下降導致了動脈血流速度減緩。綜合以上結果，我們證實了奈米銀、奈米銅對生物體不容忽視的毒性威脅；同時，也驗證了分析心血管功能的顯微攝影技術，在毒理實驗中提供了更敏感的生理指標。Item 金屬奈米顆粒對斑馬魚仔魚的影響(2017) 方鏡雅; Fang, Ching-Ya近年來奈米科技日新月異，也成為炙手可熱的科技產業之一，但是我們也需要關注金屬奈米顆粒可能對環境及生物造成的風險，在過去的研究中大多是探討金屬奈米顆粒對動物的死亡率、胚胎發育、細胞染色觀察、行為測量、基因表現，較少有更深入的發現。本篇研究目的是利用斑馬魚仔魚為動物模式，探討奈米銅(CuNP)、奈米銀(AgNP)與傳統的金屬離子硫酸銅(CuSO4)、硝酸銀(AgNO3)對仔魚的傷害。主要利用掃描式離子選擇電極技術（SIET）測量細胞的功能，結果顯示毛細胞浸泡在CuSO4、CuNP、AgNO3和AgNP 4小時後，鈣離子流入量下降，而離子細胞的氫離子梯度顯著下降，這說明了毛細胞與離子細胞功能明顯下降。利用FM1-43 及Rhodamine123標定側線毛細胞、離子細胞，結果顯示仔魚浸泡CuSO4、CuNP、AgNO3和AgNP 4小時後，毛細胞數目顯著下降，而離子細胞密度顯著減少。利用qPCR定量分析離子細胞上參與排酸蛋白的基因，結果顯示仔魚浸泡CuSO4、CuNP、AgNO3、AgNP 24小時後，nhe3b的mRNA表現量有顯著提升，表示仔魚可能對Na+吸收與H+排出受到影響，所以SIET測量到H+排出減少可能與此有關。利用CellROX標定產生reactive oxygen species (ROS)的離子細胞，結果顯示離子細胞在CuSO4 (0.5 ppm)、CuNP ( ppm)、AgNO3 (50 ppm)和AgNP (0.1 ppm) ROS有顯著上升，這可能是造成細胞損傷的原因之一。仔魚浸泡在CuSO4、CuNP、AgNO3及AgNP 4小時後，逆流行為顯著下降，最大游泳速度結果顯示只有CuSO4 (0.5 ppm)、CuNP (0.5 ppm)組有顯著下降，在活動力的測量結果發現仔魚只有在AgNO3 (50 ppm) 及AgNP (1.5 ppm)有顯著降低。綜合以上結果證實CuNP、AgNP除了會造成行為異常、細胞產生ROS及基因表現量改變害之外，另外也發現細胞的功能有受到影響，然而金屬奈米顆粒造成細胞的傷害機制仍需進一步研究。Item 利用離體電生理模式探討斑馬魚端腦雙側之功能性連結及突觸可塑性(2016) 陳郁嵐; Chen, Yu-Lan腦側化(cerebral lateralization)為一種脊椎動物常見的現象，意指大腦兩側半球各自對不同的功能扮演較優勢的角色(dominant)；腦側化對於生物個體的行為表徵扮演著重要的角色，例如人類的左右腦各負責不同類型的工作；又或是魚類會利用兩眼視覺系統，區別熟悉與陌生的環境。硬骨魚的端腦(telencephalon)被認為與學習和記憶的形成有關，特別是端腦的背外側區(dorsal lateral, Dl)及背中側區(dorsal medial, Dm)最為相關，前人利用螢光染劑DiI注射於Dl腦區後，可在Dm腦區偵測到螢光訊號，證明了Dl和Dm腦區間存在神經投射的連結。近年來，斑馬魚已成為探討學習與記憶、藥物成癮以及焦慮等行為非常重要的模式物種。從斑馬魚的胚胎發育研究以及行為觀察，已有充分的證據顯示斑馬魚腦部和哺乳類一樣，具有腦側化的現象，但關於斑馬魚端腦腦側化的研究卻非常缺乏。因此，本實驗目的為利用電生理技術探討傳遞到同側(ipsilateral)以及對側(contralateral)的Dl-Dm投射路徑的神經傳遞與突觸可塑性(synaptic plasticity)現象的異同。首先，實驗測得在單側的Dl給予電刺激，能夠在同側以及對側的Dm引發一個負電位的電場電位(negative field potential)，還可利用高頻電刺激(high frequency stimulation, HFS) 及低頻電刺激(low frequency stimulation, LFS)，分別誘發出長期增益效應(long-term potentiation, LTP)以及長期抑制效應(long-term depression, LTD) ，這兩項均為探討神經突觸可塑性的重要性指標。實驗中利用連續五次的HFS (每秒100 Hz)來誘發LTP，結果顯示在同側及對側的Dm腦區所誘發的LTP現象，此外，如預先投予NMDA受器的拮抗劑D-AP5 (30 μM)10分鐘後才進行誘發，可完全阻斷對側LTP的產生。但將D-AP5藉由灌流廓清後，則又可重新利用HFS誘發出LTP。由此證實了HFS所誘發的對側LTP，需依賴NMDA受器的活化。將左右兩側誘發的LTP實驗結果，經交叉比對分析後發現，從左側及右側的Dl給予HFS，所誘發出的同側LTP會有所差異，從右側誘發出的LTP強度會比左側誘發的小，而單從右側Dl誘發的LTP而言，其訊號強度同側會較對側的小。本實驗接着以LFS (每秒1 Hz)持續刺激20分鐘，或是投予代謝型谷氨酸受體興奮劑DHPG (40 μM) 10分鐘來誘發LTD，兩者都能誘發出至少維持一小時的LTD現象。而我們將以代謝型谷氨酸受體興奮劑DHPG所誘發的同側及對側結果比較後，我們發現對側的抑制效果較同側好。另外，Dm腦區所誘發的電場電位可以分成突觸的(synaptic, P1)以及非突觸的(non-synaptic, N2)組成，而對側Dm腦區的P1時間較同側Dm腦區的時間長，可能造成的原因為對側端腦的紀錄點較同側端腦紀錄點的距離更遠，因此有對側P1時間較同側長的現象。另外，藉由即時聚合酶鏈鎖反應(Real-time polymerase chain reaction, Real-time PCR)技術，我們發現NMDAR1a受器的mRNA在左側端腦的表現上高於右側端腦的趨勢。綜合而言，本研究的重要發現為首次觀察到斑馬魚端腦的Dl腦區和Dm腦區之間，存在著同側以及對側神經連結的突觸可塑性現象，並運用了電生理模式證明了斑馬魚端腦具有腦側化的現象。本研究成果將有助於日後為利用基因轉殖斑馬魚探討端腦腦側化分子機轉奠定基礎。