學位論文
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Item 水通道蛋白8aa在斑馬魚仔魚上的功能性研究(2012) 高揚彥; Kao, Yang-Yen水通道蛋白(aquaporins, AQPs)是一群執行水分子通透的細胞膜蛋白。此外，有些AQPs也被發現具有二氧化碳、甘油、氨與尿素的通透性。最近研究將斑馬魚(Danio rerio) aqps基因表現於蛙卵會增加細胞膜對二氧化碳/NH3通透性。然而，目前仍沒有活體的實驗證實AQPs在動物體內參與二氧化碳(carbon dioxide, CO2)及NH3的通透能力。在本篇研究中，在原位雜交反應的結果中發現aqp8aa主要表現於斑馬魚仔魚的鰓上及皮膚上，而在利用免疫組織染色搭配原位雜交反應的結果發現AQP8AA主要在皮膚上表現於兩型的離子細胞上(HR cells and NaR cells)。而在高氨馴養(10 mM NH4+)的情況下aqp8aa的mRNA表現量有顯著提升的情況，而在高碳酸水馴養的情況下卻無此情況產生。利用反義核酸(morpholino oligonucleotides)抑制aqp8aa蛋白質的表現後，利用掃描式離子選擇性電極(scanning ion-selective technique, SIET)來分析H+及NH4+在斑馬魚仔魚皮膚及離子細胞上的運輸。在knockdown aqp8aa表現後，發現仔魚整體的H+及NH4+的排放量都有下降的情況，而在特定細胞也有相似的結果，而在CO2短暫灌流的結果中也發現魚體對於H+排放量都有下降的情況，在特定細胞也有相似的結果，由此結果推論AQP8AA在斑馬魚的仔魚上可能參與著此三物質的運輸。Item 保護劑對斑馬魚側線機械性傳導通道之影響(2012) 莊偉民; Wei-Min Chuang毛細胞的機械性傳導通道（mechanotransducer channel, MET channel）會受到機械性刺激而開啟。陽離子經由MET通道流入造成毛細胞發生去極化，而釋放神經傳遞物質。胺基糖苷類（aminogly- cosides, AGs）抗生素在臨床上被用於治療革蘭氏陰性菌感染的疾病，但是AGs常導致許多副作用包括內耳毛細胞的損傷，甚至聽力喪失。魚類側線毛細胞為一種機械性接受器，負責感覺外在水體的流動。哺乳動物內耳與魚類側線的毛細胞，兩者不論是構造形態或功能特性都有相似之處，因此斑馬魚常被採用作為耳毒性藥物篩選的模式動物。然而對於毛細胞MET通道的特性目前仍沒有很好的驗證方式。本研究應用非侵入掃描式離子選擇電極技術(scanning ion-selective electrode technique, SIET)，針對斑馬魚胚胎的MET通道進行特性分析。毛細胞的纖毛束經微電極的機械性刺激後，可記錄到鈣離子流入，但是鉀離子與鈉離子的通透並不顯著。並且鈣離子流入會被AGs（neomycin和gentamicin）的短時間（30分鐘）處理所抑制，顯示MET通道可能被AGs所阻斷。將環境中鈣離子濃度從0.2 mM提高到2 mM，可減少neomycin和gentamicin對MET通道的阻斷；而提高水中的鎂離子濃度到5 mM，卻只能降低gentamicin對MET通道的阻斷。Amiloride過去被認為是一種MET通道的阻斷劑。本研究發現amiloride並無法阻斷側線毛細胞MET通道的鈣離子流入，但卻可降低AGs對MET通道的阻斷作用。Item 水通道蛋白(aqp1a)在斑馬魚胚胎表皮參與二氧化碳的運送(2011) 趙珮伶; Pei-lin Chao水通道蛋白(aquaporins, AQPs)是一群執行水分子通透的細胞膜蛋白。此外，有些AQPs也被發現具有二氧化碳、甘油、氨與尿素的通透性。因此AQPs 依其功能又區分成三亞群，分別為aquaporins, aquaammoniaporins, 與 aquaglyceroporins三群。在哺乳類研究發現，AQP1缺失的紅血球會降低二氧化碳通透性。最近研究將斑馬魚(Danio rerio) aqp1a表現於蛙卵會增加細胞膜對二氧化碳通透性。然而，目前仍沒有活體的實驗證實AQPs在動物體內參與二氧化碳(carbon dioxide, CO2)通透。本研究利用斑馬魚仔魚為模式動物，探討aqp1a在仔魚表皮細胞上的分佈與功能。將1 % CO2馴養一週的仔魚以real-time PCR分析，結果顯示aqp1a mRNA表現量增加。利用原位雜交與抗體染色標定，發現aqp1a大量表現於卵黃囊表皮上的H+-pump-rich cell與Na+ -pump-rich cell，其他表皮細胞則有少量的表現。利用morpholino knockdown弱化aqp1a蛋白的表現再利用離子選擇電極技術(SIET)分析碳酸排放，發現aqp1a基因弱化的仔魚碳酸的排放減少，顯示aqp1a在胚胎體表細胞扮演CO2通透的功能。Item 斑馬魚仔魚體表排氨功能與機制之研究(2008) 施廷翰淡水魚類移除體內含氮廢物最佳的方式，是直接將廢物以氨(ammonia，即NH3與NH4+)的形式排放到水體。具研究顯示，80%以上的氨會經由鰓排出。然而目前針對魚類鰓表皮細胞所作的研究仍未足以提供直接的證據說明排氨的運行方式。本實驗選用斑馬魚仔魚為模式動物，透過其體表的離子調節功能探討淡水魚類的排氨機制。 在本實驗中，利用掃描式離子選擇性電極技術（Scanning Ion-selective Electrode Technique, SIET）對仔魚體表離子作檢測。實驗發現在富含氫幫浦細胞( HRC）上的排氨的程度高於周遭的平舖細胞（PVC）與其它類型的離子細胞(Ionocyte)。以往的研究推論氫離子（H+）與排氨之間有密切的關係。在本實驗中，針對氫幫浦而使用的抑制劑bafilomycin A1與gene knockdown技術，會同時造成魚類H+與NH4+的梯度顯著降低。當給予水體高量緩衝溶液（5 mM 3-morpholinopropane sulfonic acid, MOPS）時，也發現H+與NH4+ 的排出量顯著下降。本實驗亦以SIET分析Rhcg1的功能，發現rhcg1 knockdown的仔魚其體表以及細胞排氨量明顯降低。綜合以上結果，本實驗證實仔魚體表細胞透過酸捕捉機制進行排氨功能，也為氫幫浦及Rhcg1提供參與排氨機制的直接證據。Item 斑馬魚空間記憶學習作業之不對稱行為表現－探討動物腦側化對行為的影響(2008) 吳曜如; Yao-Ju Wu隨着基因轉殖斑馬魚製備技術及相關分生檢測技術的不斷進步，斑馬魚用於神經科學的研究日漸增多，近有證據明顯示斑馬魚具有與人類相似的腦側化現象。本研究延續前人的理論基礎，利用改良之斑馬魚T字形迷宮空間記憶學習模式，藉以找出學習過程中，不同學習方向所導致之學習行為差異。並且進一步利用此差異，針對可能與空間記憶有關的端腦部位，進行不可恢復的雙側或單側手術破壞，觀察其於空間記憶學習行為之影響，以探討斑馬魚端腦是否具有類似人類的腦側化現象。 本研究中總共分為三部份實驗，第一部份利用大量未經處理之動物(naïve animal)進行測試，建立固定的標準訓練程序。此程序以訓練動物學習之方向可分為左側學習與右側學習兩種。實驗結果顯示，動物在往右側學習時，會呈現出學習曲線(p(naïve-R)< 0.0078)，但往左側學習時，並沒有如此顯著的情況(p(Naïve-L) = 0.1409)。此外，右側學習組的動物在第一次選擇的表現上，其方向的決定會自高比例選擇左側轉變為高比例選擇右側，然而往左側學習的動物則並表現出接近亂數選擇的情況。 第二部份實驗是對動物進行全端腦的破壞手術，並依照第一部份之標準程序進行訓練。實驗結果顯示經假手術處理的sham組動物，其左側或右側學習結果均和第一部份的結果相似。但雙側端腦遭破壞之lesion組動物，右側學習組的動物並沒有呈現出學習曲線，而左側學習組的動物表現出較快的速度游入目標區，但第一次在交接處進行選擇時，動物並沒有直接選擇向左。第三部份實驗是對動物的單側端腦進行破壞，並和第二部分一樣使用第一部份之標準程序進行訓練，藉此觀察比較動物的學習表現。結果顯示，右側端腦對右側方向的學習，扮演較左側端腦更加關鍵的角色。而左側端腦則可能與動物的情緒處理上較為相關。 近期文獻提出之斑馬魚腦側化現象中，認為右眼系統在斑馬魚決定是否咬取食物與辨識熟悉物體時較為優先；左眼系統的功能則在觀察陌生環境或是辨認新物體。本研究結果顯示，目標區域所在的位置，亦即動物為左側學習組或右側學習組，對於動物的學習表現有其一定的影響。而斑馬魚只有在右側學習時會呈現出較接近傳統學習的模式。我們推測，這樣的差別其原因為斑馬魚的端腦具有功能性腦側化現象，而在右側學習模式，斑馬魚右側的端腦扮演了較為重要的角色。Item 利用冷誘導及肌肉專一性系統轉殖肌酸激酶增進魚類低溫耐受度(2006) 林大暉; Ta-Huei Lin生活在熱帶及亞熱帶地區的魚類因為適應了溫暖的環境，因此在冬天時容易因為低溫而造成傷害。為了改善寒害所帶來的重大經濟損失，著手研究改善魚類對於低溫的耐受度是一個重要的課題。在本次的研究中，我們分析了鯉魚第三肌肉型肌酸激酶的生化功能，發現在低溫下，第三肌肉型肌酸激酶仍然穩定以及具有活性，因此第三肌肉型肌酸激酶可能扮演幫助鯉魚在低溫下生活時，能量代謝的一個重要的角色。因此我們分別製備了以三種不同的啟動子表現鯉魚第一型和第三肌肉型肌酸激酶的質體，並使用螢光蛋白作為篩選的標記。 藉著基因轉殖技術將鯉魚第三肌肉型肌酸激酶轉殖到實驗模式魚種（斑馬魚）中，它可以藉由表現持續且足夠強的抗寒能力，而使魚體在攝氏13℃仍能正常的泳動及生活，但是轉殖鯉魚第一肌肉型肌酸激酶並沒有改善基因轉殖斑馬魚在攝氏13℃水溫中的泳動能力。因此可知，此為面臨寒害影響的熱帶及亞熱帶魚類，欲在低溫下維持其代謝能力一個重要的指標。而斑馬魚是一個作為熱帶及亞熱帶地區魚類寒害影響改善研究的良好酵素轉殖基因平台之模式魚種。 本次研究結果顯示：在低溫下，野生型斑馬魚和基因轉殖斑馬魚的泳動能力有明顯的差異，而冷誘導啟動子和鯉魚第三肌肉型肌酸激酶啟動子更可以適時的表現鯉魚第三肌肉型肌酸激酶，增加基因轉殖斑馬魚的泳動能力。第三肌肉型肌酸激酶確實可以改善魚類對於寒冷低溫的耐受性，此外，應用於斑馬魚的成功範例可做為日後應用於國內各種易受寒害影響的經濟魚種之重要指標。Item 斑馬魚仔魚富含氫幫浦細胞對環境酸鹼值改變之短期調節機制(2009) 陳鶴文; Ho-Wen Chen魚類胚胎或仔魚必須進行酸鹼調節以應付水中酸鹼變動。斑馬魚仔魚體表上的富含氫幫浦細胞(HRCs)是主要魚體排酸的細胞。本實驗目的是探討斑馬魚仔魚排酸的短期調節機制。利用掃瞄式電子顯微鏡和共軛焦顯微鏡來觀察和量化HRCs的頂膜開口型態和密度。並利用掃瞄離子電極技術(SIET)來測量魚體內酸鹼值和魚體排出氫離子的能力。結果顯示當仔魚由pH 7轉移到pH 4環境30分鐘後，魚體內氫離子濃度有顯著增加。仔魚馴養在pH 4環境中，HRCs的頂膜開口面積和密度顯著大於馴養在pH 7環境下的仔魚。當仔魚由pH 4轉移到pH 7環境10分鐘之內，HRCs頂膜開口面積顯著下降，同時可以觀察到頂膜型態皺縮和內吞現象。然而，當仔魚由pH 7轉移到pH 4環境4小時後，HRCs頂膜開口面積才會逐漸增加。本研究證實斑馬魚仔魚具有短期調節排酸的機制。Item 順鉑對斑馬魚仔魚側線毛細胞和皮膚離子細胞之影響(2013) 鄒宜玲; Yi-Ling Chou摘要 Cisplatin在臨床上是最廣泛用於治療惡性腫瘤的藥物之一。然而，cisplatin常會造成的副作用包括腎毒性和耳毒性的傷害。斑馬魚已經被廣泛用來作為模式動物，研究藥物對胚胎發育以及生理功能的影響。過去研究發現cisplatin對斑馬魚側線毛細胞也會造成傷害，因此利用斑馬魚作為研究毛細胞的毒理模式。然而，目前仍未有研究利用斑馬魚去探討cisplatin的腎毒性。斑馬魚胚胎皮膚上分布數種離子細胞與哺乳動物腎臟上皮細胞有許多相似之處，因此本實驗想探討cisplatin對於斑馬魚離子細胞的影響。分析cisplatin對斑馬魚胚胎毛細胞與離子細胞的發育與功能的影響結果顯示，短時間處理濃度500 μM cisplatin 30分鐘後，顯著抑制斑馬魚胚胎側線毛細胞上的機械通道鈣離子流入，顯示毛細胞的功能受損。胚胎處理10 μM cisplatin四天後，毛細胞鈣離子流不但下降，而且毛細胞數目也顯著減少。在離子細胞的部分，處理1000 μM cisplatin 30分鐘後，會顯著降低離子細胞的排酸能力。同時離子細胞的粒腺體染色(??)性降低，顯示粒線體受到損傷。處理100 μM cisplatin 4天後，不但胚胎排酸量顯著受到抑制，也發現離子細胞數目減少。Item 以斑馬魚模式進行腦功能側化相關研究(2017) 吳曜如; Wu, Yao-Ju斑馬魚(Denio rerio)因其胚胎透明、容易飼養及觀察等優點，近年成為神經與發育生物學研究之新興動物模式。斑馬魚的神經系統與大多數硬骨魚類似，其端腦 (telencephalon) 的主要構造、相對體積大小、解剖位置及功能與哺乳類之邊緣系統 (limbic system) 相似，為一個易於操作的端腦功能研究模式。本篇論文即利用斑馬魚的各項研究優勢，進行三個部分的研究，以探討斑馬魚端腦的功能、相關之運作過程與訊息傳遞之機轉。在第一章中，我們延續先前的實驗成果，利用吸引法(aspiration)對端腦進行直接的破壞，以探究端腦在空間記憶形成上所扮演的角色，結果顯示端腦的左、右兩半球，分別對於空間及情緒性記憶 (emotional memory) 有著不同的影響，特別是在獲取 (acquisition) 及重新擷取 (retrieval) 的過程中，而對端腦進行單側破壞(unilateral ablation)，均可干擾情緒性記憶的形成。在第二章中，由於過去文獻發現X染色體脆折症 (fragile X syndrome) 患者在腦側化 (cerebral lateralization) 的表現上受到影響，故藉著fmr1基因剔除品系斑馬魚，探討此斑馬魚身上，是否會呈現類似人類病患之異常情緒性行為，結果證實了fmr1之缺損，會造成斑馬魚情緒性行為之發展異常，也會干擾了抑制性逃避記憶 (inhibitory avoidance memory) 的形成。在第三章中，主要使用了電生理的實驗方式，探究斑馬魚端腦外側 (Dl) 到端腦內側 (Dm) 之訊號傳遞。我們發現不只通往同側的端腦內側 (ipsilateral telencephalic Dm region) 有訊號傳遞，而在對側 (contralateral) 端腦之內側亦有類似的訊號傳遞，並且兩側同時存在着代表神經可塑性的長期增强效應long-term potentiation (LTP) 及長期抑制效應long-term depression (LTD) 現象，兩者的作用機制需要麩胺酸NMDA及代謝性受體 (metabotropic glutamate receptor) 的參與；其神經可塑性之LTP與LTD模式，在左、右側端腦中的表現並非完全相同，這呼應了第一階段的實驗結果，進一步證實了斑馬魚的左右側端腦，在處理學習與記憶的功能時，扮演著不同的角色。最後我們也發現，有別於哺乳類動物，斑馬魚主要藉由前連合 (anterior commissure) 構造進行兩側端腦的訊息傳遞。 總結上述三階段的研究成果，可證明斑馬魚端腦中亦存在著腦側化的現象，而斑馬魚確實能應用於探討腦側化的機轉研究。Item 前列腺素E2在斑馬魚酸鹼調節之功能(2018) 彭彥松; Peng, Yan-Sung前列腺素E2(Prostaglandin E2)對於魚類酸鹼平衡的調節仍是未知的。PGE2可透過四型受體(EP)，進而影響不同的生理功能。哺乳類主要利用腎臟維持酸鹼平衡，曾有研究發現PGE2參與兔子集尿管的排酸機制，而兩生類也需要透過表皮組織進行酸鹼平衡，排酸能力會受到不同的PGE2濃度而有所改變。然而，生活在水中的魚類，所需要面對環境改變的壓力比起前兩者更大，為了解PGE2與魚類酸鹼調節之間的關係，本研究將斑馬魚進行七天酸處理後發現鰓上PGE2相關的基因表現量上升。此外，將PGE2合成酵素弱化後，排酸能力、HR細胞數量以及排酸相關蛋白質的基因表現量上升。而將受體的基因ptger1a或ptger1b弱化後，在酸性環境下，可能藉由降低碳酸酐酶(ca2)基因表現量進而導致排酸能力無法上升。由此可知，PGE2可能參與斑馬魚的排酸機制，且在正常環境中的運作機制與酸性環境可能不同。