學位論文
Permanent URI for this collectionhttp://rportal.lib.ntnu.edu.tw/handle/20.500.12235/73908
Browse
5 results
Search Results
Item 以斑馬魚為動物模式研究奈米金屬對離子細胞之毒性(2021) 李致穎; Lee, Chih-Ying在21世紀，奈米科技快速發展，應用廣泛，而這也同時增加了人類接觸各種不同奈米顆粒的機會，因此針對其毒性的研究，也相形越來越重要。而其中，金屬奈米顆粒對於魚類離子細胞的潛在毒性仍未有充分的研究。本篇研究是以斑馬魚胚胎為動物模式，探討奈米銀和奈米銅對斑馬魚胚胎皮膚上的離子細胞功能之毒性作用。實驗方式是將斑馬魚的胚胎分別浸泡於奈米銀和奈米銅96小時（受精後4〜100小時(hpf)）後，檢測其全身離子含量及皮膚上離子細胞的數量和功能。暴露於奈米銀96小時後，全身Na離子和K離子含量在奈米銀濃度為3 mg/L組別中顯著下降，而Ca離子含量在濃度 ≥ 0.1 mg/L時下降。以Scanning ion-selective electrode technique(SIET)檢測胚胎皮膚的H離子分泌功能，發現在3 mg/L時功能顯著降低。以rhodamine 123（粒線體標記）來標記離子細胞，其密度在1和3 mg/L時分別降低了25%和55%，而離子細胞外觀也從橢圓形變形為棘狀形。進一步以抗體標記染色的方式檢測不同離子細胞亞型，發現奈米銀對富含H+-ATPase的HR細胞和富含Na+/K+-ATPase的NaR細胞造成不同的損傷。進一步使用掃描電子顯微鏡觀察離子細胞，其頂端開口有明顯的萎縮，這和正常功能的喪失相關。另一方面，斑馬魚胚胎暴露於奈米銅後，觀察到相同的趨勢。濃度在 ≥ 0.1 mg/L時，全身Na離子和Ca離子含量顯著降低，而在 ≥ 1 mg/L時，K離子含量降低。而濃度 ≥ 1 mg/L時，胚胎皮膚的H離子排泄功能顯著降低。在奈米銅濃度 ≥ 0.1 mg/L時，用rhodamine 123標記的活離子細胞數量顯著減少。使用掃描電子顯微鏡觀察離子細胞，其頂端開口同樣有明顯的萎縮。我們也以免疫染色方式進行離子細胞亞型(HR細胞和NaR細胞) 標記，兩者都在濃度 ≥ 1 mg/L時降低。透過檢測離子轉運蛋白/通道和鈣離子調節激素mRNA表現量，發現功能的損傷也藉由基因表達的變化反映出來。綜合以上結果證實在斑馬魚胚胎早期，奈米銀和奈米銅對其皮膚離子細胞會產生毒性和並影響其離子調節的功能。由於斑馬魚離子細胞和人類腎臟細胞，在生理功能上和對環境變化的調節反應上都有高度的相似，故此一結果也提醒我們奈米金屬對人類的腎臟細胞可能有潛在毒性。Item 氨暴露導致斑馬魚胚胎離子調節損傷及成魚行為改變(2021) 鄭倢安; Cheng, Chieh-An氨（包含氣態的NH3以及離子態的NH4+）為魚類代謝胺基酸後產生的主要含氮廢物，也是常見的環境汙染物。當魚體內氨濃度提高，將會導致魚隻中樞神經受損，抽搐、昏迷甚至死亡。然而，目前研究中多著重在高氨處理後魚類的適應機制，關於氨對魚隻離子調節功能及行為的毒性作用尚不清楚。本研究分為兩個部分，首先利用斑馬魚胚胎作為模式動物，探討氨如何對胚胎離子調節功能造成損傷，接著利用斑馬魚成魚作為模式動物，評估氨處理後斑馬魚的行為改變。在胚胎毒性研究中，浸泡於不同濃度（0、10、15、20 mM）的氯化銨溶液中96小時（4-100 hpf）後，觀察胚胎卵黃囊上離子細胞及表皮角質細胞。結果指出，20 mM氨處理後離子細胞內氧化壓力上升（CellROX螢光亮度顯著上升）且由Rhodamine 123標定的具粒線體活性離子細胞數目顯著下降，顯示粒線體活性降低。此外，以細胞免疫螢光染色標定20 mM氨處理後凋亡細胞數目顯著上升，並觀察到表皮角質細胞結構損傷。綜合以上結果發現，在高氨處理下，斑馬魚胚胎離子細胞及表皮角質細胞損傷，導致斑馬魚胚胎失去體表屏障，體內離子大量流失。而在行為實驗中，將斑馬魚浸泡於不同濃度（0、1、5、10 mM）的氯化銨溶液中4小時後，對游泳行為、社交行為、學習與記憶能力等面向進行不同實驗。結果顯示1 mM氨處理時可以促進學習記憶能力；5 mM時焦慮及恐懼程度提升且群游下降；10 mM氨處理時活動力、社交行為及焦慮程度下降，但恐懼程度上升。綜上所述，在不同濃度氨暴露以及不同的環境刺激下，斑馬魚的游泳、社交、學習等行為改變，而這些改變可能使斑馬魚存活率下降，進一步使個體適存度降低。Item 順鉑導致斑馬魚胚胎離子細胞氧化壓力與細胞凋亡(2020) 吳巧羚; Wu, Ciao-Ling順鉑為現今廣泛使用之化療藥物，卻伴隨腎毒性、神經毒性和耳毒性等副作用，其中主要限制施予劑量的因素為腎毒性。順鉑可經由銅離子運輸蛋白與有機陽離子運輸蛋白進入腎臟上皮細胞，造成腎小管損傷，目前哺乳動物細胞研究模式已知氧化壓力生成是順鉑造成細胞損傷的主要原因之一。斑馬魚是廣泛使用於毒理學研究與藥物測試的模式動物，其仔魚表皮分布的五型離子細胞與哺乳動物腎臟上皮細胞有許多相似之處，因直接暴露於環境，好操作且易觀察。本研究以斑馬魚仔魚表皮離子細胞作為研究順鉑腎毒性之工具，使用活體螢光染色觀察順鉑對離子細胞的影響，來證實順鉑會導致離子細胞氧化壓力生成、粒線體損傷和細胞凋亡。本實驗將斑馬魚胚胎浸泡於不同濃度的順鉑（0、50、100、300、500 或 1000 μM）進行長時間（4-100 hpf）或短時間（96-98 hpf）處理，再使用活體螢光染劑單染或共染的方式，標定斑馬魚仔魚卵黃囊上具粒線體活性離子細胞（Rhodamine 123/MitoTracker）與凋亡細胞（AcridineOrange），並探討當中活性氧化物的產生（CellROX/ MitoSOX）。斑馬魚胚胎分別在順鉑處理 96小時及 2 小時後，Rhodamine 123 標定具粒線體活性離子細胞數目均顯著下降，且凋亡細胞數目顯著上升；斑馬魚胚胎分別在順鉑處理 96 小時及 1 小時後，產生活性氧化物的離子細胞數目或 CellROX/MitoSOX 的螢光亮度均顯著上升。此外，將斑馬魚胚胎進行抗氧化劑 NAC（0、100、300、500 或 1000 μM）與順鉑的長時間共處理，發現 NAC 能降低胚胎的死亡率，並減緩順鉑對離子細胞所導致的氧化壓力與損害。由以上結果可證實順鉑會導致離子細胞氧化壓力生成和粒線體損傷，並引起細胞凋亡，而抗氧化劑 NAC 可作為順鉑毒性的保護劑。Item 斑馬魚仔魚體表排氨功能與機制之研究(2008) 施廷翰淡水魚類移除體內含氮廢物最佳的方式，是直接將廢物以氨(ammonia，即NH3與NH4+)的形式排放到水體。具研究顯示，80%以上的氨會經由鰓排出。然而目前針對魚類鰓表皮細胞所作的研究仍未足以提供直接的證據說明排氨的運行方式。本實驗選用斑馬魚仔魚為模式動物，透過其體表的離子調節功能探討淡水魚類的排氨機制。 在本實驗中，利用掃描式離子選擇性電極技術（Scanning Ion-selective Electrode Technique, SIET）對仔魚體表離子作檢測。實驗發現在富含氫幫浦細胞( HRC）上的排氨的程度高於周遭的平舖細胞（PVC）與其它類型的離子細胞(Ionocyte)。以往的研究推論氫離子（H+）與排氨之間有密切的關係。在本實驗中，針對氫幫浦而使用的抑制劑bafilomycin A1與gene knockdown技術，會同時造成魚類H+與NH4+的梯度顯著降低。當給予水體高量緩衝溶液（5 mM 3-morpholinopropane sulfonic acid, MOPS）時，也發現H+與NH4+ 的排出量顯著下降。本實驗亦以SIET分析Rhcg1的功能，發現rhcg1 knockdown的仔魚其體表以及細胞排氨量明顯降低。綜合以上結果，本實驗證實仔魚體表細胞透過酸捕捉機制進行排氨功能，也為氫幫浦及Rhcg1提供參與排氨機制的直接證據。Item 金屬奈米顆粒對斑馬魚仔魚的影響(2017) 方鏡雅; Fang, Ching-Ya近年來奈米科技日新月異，也成為炙手可熱的科技產業之一，但是我們也需要關注金屬奈米顆粒可能對環境及生物造成的風險，在過去的研究中大多是探討金屬奈米顆粒對動物的死亡率、胚胎發育、細胞染色觀察、行為測量、基因表現，較少有更深入的發現。本篇研究目的是利用斑馬魚仔魚為動物模式，探討奈米銅(CuNP)、奈米銀(AgNP)與傳統的金屬離子硫酸銅(CuSO4)、硝酸銀(AgNO3)對仔魚的傷害。主要利用掃描式離子選擇電極技術（SIET）測量細胞的功能，結果顯示毛細胞浸泡在CuSO4、CuNP、AgNO3和AgNP 4小時後，鈣離子流入量下降，而離子細胞的氫離子梯度顯著下降，這說明了毛細胞與離子細胞功能明顯下降。利用FM1-43 及Rhodamine123標定側線毛細胞、離子細胞，結果顯示仔魚浸泡CuSO4、CuNP、AgNO3和AgNP 4小時後，毛細胞數目顯著下降，而離子細胞密度顯著減少。利用qPCR定量分析離子細胞上參與排酸蛋白的基因，結果顯示仔魚浸泡CuSO4、CuNP、AgNO3、AgNP 24小時後，nhe3b的mRNA表現量有顯著提升，表示仔魚可能對Na+吸收與H+排出受到影響，所以SIET測量到H+排出減少可能與此有關。利用CellROX標定產生reactive oxygen species (ROS)的離子細胞，結果顯示離子細胞在CuSO4 (0.5 ppm)、CuNP ( ppm)、AgNO3 (50 ppm)和AgNP (0.1 ppm) ROS有顯著上升，這可能是造成細胞損傷的原因之一。仔魚浸泡在CuSO4、CuNP、AgNO3及AgNP 4小時後，逆流行為顯著下降，最大游泳速度結果顯示只有CuSO4 (0.5 ppm)、CuNP (0.5 ppm)組有顯著下降，在活動力的測量結果發現仔魚只有在AgNO3 (50 ppm) 及AgNP (1.5 ppm)有顯著降低。綜合以上結果證實CuNP、AgNP除了會造成行為異常、細胞產生ROS及基因表現量改變害之外，另外也發現細胞的功能有受到影響，然而金屬奈米顆粒造成細胞的傷害機制仍需進一步研究。