學位論文
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Item Rh蛋白在斑馬魚胚胎皮膚的功能(2013) 施廷翰; Tin-Han ShihRh蛋白是在脊椎動物中發現的氣體通道蛋白，被認為具有運輸氨以及二氧化碳的能力。在魚類中，鰓(成魚)以及皮膚(胚胎仔魚)都是主要用來呼吸的器官，但是目前仍不確定是由何種特定細胞來執行排氨以及二氧化碳的功能，也尚未清楚Rh蛋白在其中扮演的角色。在我的研究中，我將利用斑馬魚胚胎，證明Rh蛋白參與皮膚氨以及二氧化碳運輸的功能。 在第一章的研究中，我以螢光免疫染色證明Rhcg1表現在富含氫幫浦細胞(HR cell)的頂端細胞膜上。利用SIET分析仔魚體表細胞的排氨功能後發現，HR cell比它型表皮細胞具有更強的排氨能力，而此排氨能力也隨抑制Rhcg1的表現而顯著降低。我也發現HR cell在高氨下仍可維持排氨作用，但若是抑制氫幫浦(H+-ATPase)或Rhcg1的表現則會使得HR cell失去高氨下的排氨能力，顯示H+-ATPase以及Rhcg1是HR cell執行主動排氨的關鍵分子。 我在第二章要探討排氨以及鈉離子吸收的運輸機制。透過高氨環境抑制排氨將使得鈉離子吸收能力降低。而增加鈉離子的吸收後則使排氨量增加，顯示氨與鈉離子的運輸息息相關。抑制了Rhcg1以及鈉氫交換蛋白(Na+/H+ exchanger, NHE3b)的表現後發現排氨與吸鈉量皆降低。抑制這兩蛋白也影響了體內鈉離子的含量，顯示Rhcg1以及NHE3b是魚類進行排氨依賴性的鈉離子吸收機制的重要蛋白。 於第三章我將分析另一Rh蛋白Rhbg在仔魚皮膚上的分布與功能。利用原位雜交以及免疫螢光染色我證明Rhbg表現在皮膚keratinocyte頂端與底側端的細胞膜上。與抑制Rhcg1相比，抑制了Rhbg的表現會造成更嚴重的排氨能力失調，顯示Rhbg對於排氨的影響更大。然而，Rhbg的抑制將造成Rhcg1的表現增加以及HR cell排氨能力的提升，這些現象說明補償性的排氨機制是藉由HR cell來調節。 在最後的章節中，我分析了仔魚皮膚Rh蛋白與二氧化碳運輸的相關性。研究發現利用高氨環境會抑制二氧化碳的排放，而高碳酸水也會降低氨的排放量，顯示二氧化碳與氨可能透過同一路徑排放。抑制了Rhbg蛋白會顯著降低二氧化碳排放量，但抑制Rhcg1則不會造成此現象。本實驗也利用H+探針測量表皮二氧化碳的水合(產生H+)與碳酸的水解(減少H+)，藉以分析細胞膜對於二氧化碳的通透性。在高碳酸水的浸泡實驗中，抑制Rhbg將減少體表鹼化的程度，說明較少的二氧化碳通過表皮。這些數據證實Rhbg是魚類排放二氧化碳的重要路徑。Item 應用斑馬魚作為研究端腦突觸可塑性及智能障礙疾病的模式(2012) 吳民聰; Ming-Chong Ng硬骨魚類的端腦在學習與記憶的形成過程中扮演著重要的角色，其中又以端腦背側的外側區(Dl)與中側區(Dm)最為關鍵。利用螢光追蹤方法可發現，將螢光染劑置入D1區後，螢光物質會由Dl往Dm傳遞，這現象意味著兩者之間的神經纖維有緊密相連的關係，但目前探討Dl－Dm間突觸傳遞現象的研究還非常稀少。斑馬魚是一種廣泛應用於探討藥物成癮、焦慮以及學習和記憶等研究的模式動物。本論文的研究目的之一即以電生理技術，探討在斑馬魚端腦中Dl－Dm投射路徑的神經傳遞與突觸可塑(synaptic plasticity)現象。從結果可觀察到，在Dl給予一次電刺激能引發Dm產生一個負電位之電場電位(field potential, FP)，且該FP能被AMPA/kainate受器拮抗劑CNQX、0.5 mM Ca 2+、8.0 mM Mg 2+ 及TTX (0.5 μM)所阻斷；相反的，在無Mg 2+的人工腦脊髓液以及bicuculline中FP則能被提升並引發神經的猝發(bursting)現象。以上結果意味著興奮性與抑制性的神經傳遞作用皆可能具調節神經突觸的功能。為了探究這假說，本論文進一步探討了突觸可塑現象中的長期增益效應(LTP)與長期抑制效應(LTD) 。由結果發現，連續三次高頻刺激(每秒100Hz)或投予腺苷酸環化酶啟動劑Forskolin (50 μM) 15分鐘後皆可引發LTP現象，前者為NMDA受器依賴性LTP，而後者需要extracellular related-signal kinase (ERK)的參與。此外，投予代謝型谷氨酸受體興奮劑DHPG (25 μM) 10分鐘後，則會引發持續至少１小時的LTD現象 。由此可知，斑馬魚端腦Dl與Dm間的突觸連結為端腦突觸可塑性的關鍵角色，也在探討斑馬魚學習與記憶之神經機轉上提供了一個新的電生理模式。另外，斑馬魚在發生遺傳學等相關人類疾病的研究中也已成為不可或缺的動物模式。X染色體脆折症(Fragile X syndrome, FXS)是發生率較高的人類遺傳性智能遲滯疾病，伴隨著外型異常、認知功能以及行為障礙等症狀。FXS是由於FMR1基因發生突變造成其蛋白FMRP缺失所致，建立FXS的動物模式將有助於我們進一步瞭解致病的細胞與分子機制。因此，本論文的另一研究目的即為利用FMR1基因缺失斑馬魚，探究FMRP在行為及神經突觸可塑性中所扮演的角色。實驗結果顯示，成年斑馬魚因缺乏FMR1基因表達，而產生低焦慮、過動和抑制性逃避性學習障礙現象。而在電生理上，FMRP的缺失對於突觸傳遞功能並無明顯影響，但在突觸可塑性方面，相較於對照組，FMR1剔除斑馬魚端腦LTP的強度會減弱，相反的LTD則增強。綜合此研究的各項重要發現，我們認為FMR1基因剔除斑馬魚在未來應用上，除有助於我們瞭解FXS的致病機轉外，更能協助治療性藥物的開發。Item I. Trip6 蛋白質在小鼠腦中之表現 II. 建立人類惡性腫瘤之斑馬魚異體移植模式(2014) 楊程堯; Cheng-Yao Yang壹、 Trip6 蛋白質在小鼠腦中之表現 甲狀腺素受體作用蛋白質 6 (Thyroid receptor-interacting protein 6, Trip6)是一種焦點連接(focal adhesion)分子，它調控一些細胞機制 如：細胞之間的連接(cell adhesion)、細胞的遷移(cell migration)以及 基因轉錄的活化 (gene transactivation)。過去研究指出 Trip6 屬於幹 細胞性(stemness)的基因，在不同的幹細胞中具有較高的表現量。為了探究Trip6 在神經幹細胞所扮演的角色，我們分別檢測了 Trip6 蛋白質在胚胎與成年小鼠大腦中的表現量。發現 Trip6 的 mRNA 主要在胚胎小鼠的腦中有表現，但在成年小鼠腦中則比較低或偵測不到。其蛋白質也只可以在胚胎小鼠的大腦中被偵測到，成年小鼠則否。另外我們在胚胎與成年小鼠的大腦組織切片中，以不同的細胞標誌與 Trip6 進行組織免疫螢光染色。包括幹細胞的標誌 Sox2、增殖中細胞的標誌 Ki67、室管膜細胞的標誌 S100β、神經母細胞的標誌 DCX、神經元的標誌 MAP2、星狀細胞的標誌 GFAP 以及小膠質細胞的標誌(Iba1)。我們發現 Trip6 主要表達在胚胎小鼠的腦室區(ventricular zone, VZ)以及出生後小鼠的腦室下區(subventricular zone, SVZ)內的神經幹細胞(neural stem cells, NSC)中。這樣的結果支持Trip6 可能在調控幹細胞的特性中是一個重要的關鍵。 貳、建立人類惡性腫瘤之斑馬魚異體移植模式 神經膠質母細胞瘤是成人最常見且高侵略性的原發惡性腦腫瘤。它的侵襲力和耐傳統療法使其成為極易復發的惡性腫瘤。Rac蛋白質屬於Rho GTP酶亞家族，其主要功能包括調節細胞運動，增殖和存活。為了探究Rac蛋白質是否可以作為膠質母細胞瘤的新治療標靶，特別是對於神經膠質母細胞瘤幹細胞，我們利用其類癌幹細胞株建立了斑馬魚的異體移植模式來研究抑制Rac蛋白質對於神經膠質母細胞瘤的致癌性影響。 我們將表達控制組的shRNA或者是針對Rac蛋白質做抑制的shRNA序列和綠螢光蛋白的神經膠質母細胞瘤細胞株U251-MG和U373-MG培養於低分化培養液中，以形成腫瘤細胞球(tumorspheroids)。這些體外培養的球體細胞有著幹細胞的特性。我們將這些細胞以顯微注射的方式注射進入受精後兩天大的血管紅螢光轉基因斑馬魚Tg(kdr: mCherry)的卵黃囊。觀察發現注入的癌細胞誘導了血管新生作用的發生，而表達shRacs細胞萎縮且並未引發血管新生作用。另外，注射shRacs細胞的魚隻生存率也較高。 從我們的研究結果，Rac蛋白質會誘導膠質瘤幹細胞引發血管新生作用，並且可做為一個生物標誌。因此，Rac蛋白質可能可以進一步應用在神經膠質母細胞瘤的標靶治療上。 另一方面，我們也利用注射肝癌細胞株Hep3B進入受精後兩天大的斑馬魚卵黃囊中，來觀察Hep3B細胞的遷移現象，此模式約有20%的魚隻可觀察到細胞遷移。Item 以斑馬魚為模式調查環境酸化與鉑類化療藥物對毛細胞與離子細胞的影響(2019) 洪君儀; Hung, Giun-Yi淡水生態系統的酸化已被認為是全球性的環境問題，並導致魚類行為的變化。然而，酸性環境是否造成淡水魚側線系統的功能改變仍然是未知的。此外，許多研究揭露藥物汙染水環境的事實，其中包括抗癌化療藥物。然而這些藥物造成的環境作用、環境影響的程度與廣度鮮為人知。本研究目的在於檢視斑馬魚胚胎暴露於酸性或鹼性淡水時，是否改變了神經丘毛細胞的表達和功能。並藉由決定鉑類化療藥物(順鉑)對於表皮離子細胞與毛細胞產生影響之最小濃度，了解順鉑之亞致死效應，以應用於鉑類藥物造成水環境影響之早期風險評估。將斑馬魚胚胎暴露於不同的酸鹼pH值環境中，分析長期暴露(受精後0~96小時)與短期暴露(受精後48~96小時)對胚胎形態與側線毛細胞功能之影響。另外，將斑馬魚胚胎受精後長期暴露於不同濃度的順鉑後，分析胚胎形態、存活率、體長、及魚體的離子(鈉、氯、鈣)與鉑含量。功能分析方面，利用掃描式離子選擇電極，分析側線毛細胞功能(機械傳導通道鈣離子流)與皮膚離子細胞排酸功能。結果顯示，長期暴露於pH5條件下，側線毛細胞數量與功能皆下降。短期暴露於pH5條件下，僅毛細胞功能下降，然而毛細胞數目不變。進一步利用morpholino oligonucleotides進行基因減弱，降低H+-ATPase與 gcm2 表現，使得調節酸鹼平衡機制受損後，發現胚胎毛細胞數量與功能皆下降。此外，胚胎長期暴露於濃度由低至高的順鉑中，毛細胞功能最先受損(濃度1 µM)、隨後是毛細胞數與魚體氯離子含量下降(濃度10 µM)、離子細胞排酸能力下降及魚體鈉與鈣離子含量下降(濃度50 µM)、體長與離子細胞密度下降(100 µM)、最後是存活率下降(濃度500 µM)。研究結果顯示酸性環境會導致神經丘毛細胞功能受損。對於順鉑引起之毒性，毛細胞明顯比離子細胞更敏感。本研究利用掃描式離子選擇電極偵測毛細胞與離子細胞功能之改變，決定順鉑最低影響濃度，此法有高達500倍相較於偵測存活率變化之敏感度，未來可應用於偵測鉑類藥物對於水環境造成之早期風險評估。Item 汞對於斑馬魚仔魚側線感覺與離子調節功能之影響(2018) 潘予芹; Pan, Yu-Chin汞（Hg）是一種具高毒性的重金屬，非常容易藉由生物累積的方式進入食物鏈。其毒性取決於他的化學結構、接觸途徑以及物種，目前已有許多在人體及哺乳類動物實驗中，證明長期暴露在汞確實會造成損傷，即使是在低濃度下仍有極高的風險。先前對於汞造成斑馬魚影響的研究相當多，主題大多著重在汞對於斑馬魚胚胎時期神經與腦部發育的影響，較少去探討孵化後仔魚暴露在含汞的環境下，其皮表的離子細胞以及毛細胞的影響。本實驗利用斑馬魚仔魚作為模式物種，分別暴露於短時間（4 hrs）與長時間（48 hrs）含汞（氯化汞、甲基汞）的水體當中，觀察仔魚表皮的毛細胞與離子細胞；這兩型細胞分別負責機械性感受器的功能、排酸功能。短時間暴露於氯化汞和甲基汞後，導致仔魚表皮之毛細胞與離子細胞的細胞數目與功能下降；進而觀察到仔魚逆流行為、活動力以及體內鈣和鈉含量下降。長時間暴露後，於較低的濃度即可觀察到汞所造成的影響，包括細胞數目與功能的下降、逆流行為、體內離子含量及基因表現量的改變。另外，於本實驗我們也觀察到氯化汞與甲基汞所造成的毒性不盡相同。