學位論文
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Item 以斑馬魚為動物模式研究奈米金屬對離子細胞之毒性(2021) 李致穎; Lee, Chih-Ying在21世紀，奈米科技快速發展，應用廣泛，而這也同時增加了人類接觸各種不同奈米顆粒的機會，因此針對其毒性的研究，也相形越來越重要。而其中，金屬奈米顆粒對於魚類離子細胞的潛在毒性仍未有充分的研究。本篇研究是以斑馬魚胚胎為動物模式，探討奈米銀和奈米銅對斑馬魚胚胎皮膚上的離子細胞功能之毒性作用。實驗方式是將斑馬魚的胚胎分別浸泡於奈米銀和奈米銅96小時（受精後4〜100小時(hpf)）後，檢測其全身離子含量及皮膚上離子細胞的數量和功能。暴露於奈米銀96小時後，全身Na離子和K離子含量在奈米銀濃度為3 mg/L組別中顯著下降，而Ca離子含量在濃度 ≥ 0.1 mg/L時下降。以Scanning ion-selective electrode technique(SIET)檢測胚胎皮膚的H離子分泌功能，發現在3 mg/L時功能顯著降低。以rhodamine 123（粒線體標記）來標記離子細胞，其密度在1和3 mg/L時分別降低了25%和55%，而離子細胞外觀也從橢圓形變形為棘狀形。進一步以抗體標記染色的方式檢測不同離子細胞亞型，發現奈米銀對富含H+-ATPase的HR細胞和富含Na+/K+-ATPase的NaR細胞造成不同的損傷。進一步使用掃描電子顯微鏡觀察離子細胞，其頂端開口有明顯的萎縮，這和正常功能的喪失相關。另一方面，斑馬魚胚胎暴露於奈米銅後，觀察到相同的趨勢。濃度在 ≥ 0.1 mg/L時，全身Na離子和Ca離子含量顯著降低，而在 ≥ 1 mg/L時，K離子含量降低。而濃度 ≥ 1 mg/L時，胚胎皮膚的H離子排泄功能顯著降低。在奈米銅濃度 ≥ 0.1 mg/L時，用rhodamine 123標記的活離子細胞數量顯著減少。使用掃描電子顯微鏡觀察離子細胞，其頂端開口同樣有明顯的萎縮。我們也以免疫染色方式進行離子細胞亞型(HR細胞和NaR細胞) 標記，兩者都在濃度 ≥ 1 mg/L時降低。透過檢測離子轉運蛋白/通道和鈣離子調節激素mRNA表現量，發現功能的損傷也藉由基因表達的變化反映出來。綜合以上結果證實在斑馬魚胚胎早期，奈米銀和奈米銅對其皮膚離子細胞會產生毒性和並影響其離子調節的功能。由於斑馬魚離子細胞和人類腎臟細胞，在生理功能上和對環境變化的調節反應上都有高度的相似，故此一結果也提醒我們奈米金屬對人類的腎臟細胞可能有潛在毒性。Item 銀離子於酸性環境中對斑馬魚胚胎發育及離子調控之危害(2021) 孔耕心; Kung, Geng-Xin奈米銀在近年來被廣泛地運用於醫療及化妝品產業，其廢棄材料表面釋放出的銀離子會危害水生生物。然而，目前對於銀離子在不同酸鹼值環境中的毒性差異並不瞭解。本研究利用斑馬魚胚胎為水生生物模式，將其暴露於含有0、0.1及0.25 ppm AgNO3之pH 5或pH 7環境中，以評估銀離子毒性的差異。在暴露96小時的結果中可以得知銀離子的胚胎發育影響程度隨著濃度升高而增加。在銀離子的暴露後胚胎體長顯著下降，而卵黃囊面積則會增加。銀離子亦導致胚胎耳石囊面積及耳石面積下降，影響胚胎的內耳系統。另外，側線神經丘及毛細胞數目下降也反映出銀離子對胚胎側線的影響。值得注意的是：酸環境(pH 5)中會增加銀離子在體長、卵黃囊、耳石囊以及耳石上的影響。另一方面，銀離子降低離子細胞開口面積及數目，阻礙胚胎的離子調節功能，並且導致NaRC及HRC數目顯著降低，增加胚胎適應酸環境的困難性。另外，30分鐘及2小時的實驗中可發現：銀離子會藉由增加離子細胞的氧化壓力程度，進而誘發細胞凋亡機制。總結以上結果，本研究認為酸環境會增加銀離子對魚類的危害。Item 斑馬魚仔魚體表排氨功能與機制之研究(2008) 施廷翰淡水魚類移除體內含氮廢物最佳的方式，是直接將廢物以氨(ammonia，即NH3與NH4+)的形式排放到水體。具研究顯示，80%以上的氨會經由鰓排出。然而目前針對魚類鰓表皮細胞所作的研究仍未足以提供直接的證據說明排氨的運行方式。本實驗選用斑馬魚仔魚為模式動物，透過其體表的離子調節功能探討淡水魚類的排氨機制。 在本實驗中，利用掃描式離子選擇性電極技術（Scanning Ion-selective Electrode Technique, SIET）對仔魚體表離子作檢測。實驗發現在富含氫幫浦細胞( HRC）上的排氨的程度高於周遭的平舖細胞（PVC）與其它類型的離子細胞(Ionocyte)。以往的研究推論氫離子（H+）與排氨之間有密切的關係。在本實驗中，針對氫幫浦而使用的抑制劑bafilomycin A1與gene knockdown技術，會同時造成魚類H+與NH4+的梯度顯著降低。當給予水體高量緩衝溶液（5 mM 3-morpholinopropane sulfonic acid, MOPS）時，也發現H+與NH4+ 的排出量顯著下降。本實驗亦以SIET分析Rhcg1的功能，發現rhcg1 knockdown的仔魚其體表以及細胞排氨量明顯降低。綜合以上結果，本實驗證實仔魚體表細胞透過酸捕捉機制進行排氨功能，也為氫幫浦及Rhcg1提供參與排氨機制的直接證據。Item 順鉑對斑馬魚仔魚側線毛細胞和皮膚離子細胞之影響(2013) 鄒宜玲; Yi-Ling Chou摘要 Cisplatin在臨床上是最廣泛用於治療惡性腫瘤的藥物之一。然而，cisplatin常會造成的副作用包括腎毒性和耳毒性的傷害。斑馬魚已經被廣泛用來作為模式動物，研究藥物對胚胎發育以及生理功能的影響。過去研究發現cisplatin對斑馬魚側線毛細胞也會造成傷害，因此利用斑馬魚作為研究毛細胞的毒理模式。然而，目前仍未有研究利用斑馬魚去探討cisplatin的腎毒性。斑馬魚胚胎皮膚上分布數種離子細胞與哺乳動物腎臟上皮細胞有許多相似之處，因此本實驗想探討cisplatin對於斑馬魚離子細胞的影響。分析cisplatin對斑馬魚胚胎毛細胞與離子細胞的發育與功能的影響結果顯示，短時間處理濃度500 μM cisplatin 30分鐘後，顯著抑制斑馬魚胚胎側線毛細胞上的機械通道鈣離子流入，顯示毛細胞的功能受損。胚胎處理10 μM cisplatin四天後，毛細胞鈣離子流不但下降，而且毛細胞數目也顯著減少。在離子細胞的部分，處理1000 μM cisplatin 30分鐘後，會顯著降低離子細胞的排酸能力。同時離子細胞的粒腺體染色(??)性降低，顯示粒線體受到損傷。處理100 μM cisplatin 4天後，不但胚胎排酸量顯著受到抑制，也發現離子細胞數目減少。