學位論文
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Item 利用斑馬魚胚胎模式研究烯酸酯類殺菌劑pyraclostrobin 之毒性(2023) 葉凡瑄; Yeh, Fan-Hsuan百克敏(pyraclostrobin)是一種被大量使用的農業除真菌劑，透過地表徑流等途徑汙染環境，在世界各地的水域已被檢出。其對於水生生物包括魚類以及兩棲類，具有極高的非專一毒性。先前研究證實百克敏對於斑馬魚具有粒線體毒性、心毒性並造成發育延遲、增加氧化壓力、降低活動力。但對魚類其他生理功能的影響仍不清楚。本研究利用斑馬魚胚胎作爲毒理模式，將其曝露於100-1000 ppb的百克敏96小時後，觀察其對於基因表現、離子調節、側線感覺功能的變化；曝露百克敏120小時後，觀察聽覺與視覺行爲的改變。並利用轉基因螢光魚觀察中樞神經系統的影響。結果顯示百克敏96小時半致死濃度為204.6 ppb。濃度≥100 ppb 造成心率下降、側線毛細胞損傷、觸碰逃跑速度下降；濃度≥150 ppb造成體長降低，眼睛、耳石囊、耳石面積變小，卵黃消耗減少，體内Ca2+、K+離子含量下降，離子細胞數目減少；濃度200 ppb造成圍心腔水腫、皮膚幹細胞減少以及側線毛細胞減少。利用RNA定序分析基因表現發現許多異常包括:離子調節(atp1a1a, atp2b,atp6v, kcnj1a, rhcg)、側線感覺(cib2, myo6b, s100)、粒線體電子傳遞鏈(cytb, cox3、cox19)、內耳感覺(otomp, cep290, oc90)、視覺(cabp5a, clcc1)、細胞凋亡(casp3, casp8, casp17)等相關基因。在行為實驗發現，百克敏會降低聲音驚嚇反應之敏感度，並延長視覺運動反應時間。螢光魚的結果顯示，百克敏會造成脊髓運動神經元減少。綜上所述，本研究提出百克敏可能會造成魚類離子調節、周邊感覺(側線、視覺、聽覺)以及中樞神經異常，對魚類生存造成威脅，需更審慎評估百克敏的使用。Item 芬普尼及酸性水的暴露對於斑馬魚胚胎發育及離子調節之影響(2022) 彭元廷; Peng, Yuan-Ting人類活動引發的淡水酸化已成為全球性的問題，並且已對水生動物構成嚴重的威脅，而酸性水可能會增加水中污染物對水生動物的毒性。芬普尼 (fipronil)是一種苯基吡唑類殺蟲劑，目前廣泛使用於農業活動和寵物用藥。先前的研究表明，芬普尼的殘留物會對魚類造成多種毒性作用。然而，目前尚不清楚芬普尼是否會損害魚類的離子調節及酸化水是否會增強芬普尼的毒性。在這項研究中，斑馬魚胚胎被當成模式動物來回答這些問題。從受精後 4 小時開始，斑馬魚胚胎暴露在不同濃度 (0、0.1、0.5、1、5 和 10 ppm)的芬普尼中 96 小時。芬普尼以劑量依賴性的方式增加死亡率並延遲孵化。 芬普尼 (≧ 1 ppm) 的毒性亦使得身體及肌節的長度、眼睛、耳石囊和嗅窩的面積都與控制組相比呈現下降。此外，芬普尼還降低了側線毛細胞及皮膚離子細胞 (包括 HR 細胞和 NaR 細胞)的數量以及相關的離子調節功能。在酸性水 (pH5) 中，芬普尼導致離子細胞酸分泌的功能更嚴重地下降。這項研究首次表明芬普尼可以損傷皮膚離子細胞並威脅魚類在酸性環境中的生存。Item 氨暴露導致斑馬魚胚胎離子調節損傷及成魚行為改變(2021) 鄭倢安; Cheng, Chieh-An氨（包含氣態的NH3以及離子態的NH4+）為魚類代謝胺基酸後產生的主要含氮廢物，也是常見的環境汙染物。當魚體內氨濃度提高，將會導致魚隻中樞神經受損，抽搐、昏迷甚至死亡。然而，目前研究中多著重在高氨處理後魚類的適應機制，關於氨對魚隻離子調節功能及行為的毒性作用尚不清楚。本研究分為兩個部分，首先利用斑馬魚胚胎作為模式動物，探討氨如何對胚胎離子調節功能造成損傷，接著利用斑馬魚成魚作為模式動物，評估氨處理後斑馬魚的行為改變。在胚胎毒性研究中，浸泡於不同濃度（0、10、15、20 mM）的氯化銨溶液中96小時（4-100 hpf）後，觀察胚胎卵黃囊上離子細胞及表皮角質細胞。結果指出，20 mM氨處理後離子細胞內氧化壓力上升（CellROX螢光亮度顯著上升）且由Rhodamine 123標定的具粒線體活性離子細胞數目顯著下降，顯示粒線體活性降低。此外，以細胞免疫螢光染色標定20 mM氨處理後凋亡細胞數目顯著上升，並觀察到表皮角質細胞結構損傷。綜合以上結果發現，在高氨處理下，斑馬魚胚胎離子細胞及表皮角質細胞損傷，導致斑馬魚胚胎失去體表屏障，體內離子大量流失。而在行為實驗中，將斑馬魚浸泡於不同濃度（0、1、5、10 mM）的氯化銨溶液中4小時後，對游泳行為、社交行為、學習與記憶能力等面向進行不同實驗。結果顯示1 mM氨處理時可以促進學習記憶能力；5 mM時焦慮及恐懼程度提升且群游下降；10 mM氨處理時活動力、社交行為及焦慮程度下降，但恐懼程度上升。綜上所述，在不同濃度氨暴露以及不同的環境刺激下，斑馬魚的游泳、社交、學習等行為改變，而這些改變可能使斑馬魚存活率下降，進一步使個體適存度降低。Item 順鉑導致斑馬魚胚胎離子細胞氧化壓力與細胞凋亡(2020) 吳巧羚; Wu, Ciao-Ling順鉑為現今廣泛使用之化療藥物，卻伴隨腎毒性、神經毒性和耳毒性等副作用，其中主要限制施予劑量的因素為腎毒性。順鉑可經由銅離子運輸蛋白與有機陽離子運輸蛋白進入腎臟上皮細胞，造成腎小管損傷，目前哺乳動物細胞研究模式已知氧化壓力生成是順鉑造成細胞損傷的主要原因之一。斑馬魚是廣泛使用於毒理學研究與藥物測試的模式動物，其仔魚表皮分布的五型離子細胞與哺乳動物腎臟上皮細胞有許多相似之處，因直接暴露於環境，好操作且易觀察。本研究以斑馬魚仔魚表皮離子細胞作為研究順鉑腎毒性之工具，使用活體螢光染色觀察順鉑對離子細胞的影響，來證實順鉑會導致離子細胞氧化壓力生成、粒線體損傷和細胞凋亡。本實驗將斑馬魚胚胎浸泡於不同濃度的順鉑（0、50、100、300、500 或 1000 μM）進行長時間（4-100 hpf）或短時間（96-98 hpf）處理，再使用活體螢光染劑單染或共染的方式，標定斑馬魚仔魚卵黃囊上具粒線體活性離子細胞（Rhodamine 123/MitoTracker）與凋亡細胞（AcridineOrange），並探討當中活性氧化物的產生（CellROX/ MitoSOX）。斑馬魚胚胎分別在順鉑處理 96小時及 2 小時後，Rhodamine 123 標定具粒線體活性離子細胞數目均顯著下降，且凋亡細胞數目顯著上升；斑馬魚胚胎分別在順鉑處理 96 小時及 1 小時後，產生活性氧化物的離子細胞數目或 CellROX/MitoSOX 的螢光亮度均顯著上升。此外，將斑馬魚胚胎進行抗氧化劑 NAC（0、100、300、500 或 1000 μM）與順鉑的長時間共處理，發現 NAC 能降低胚胎的死亡率，並減緩順鉑對離子細胞所導致的氧化壓力與損害。由以上結果可證實順鉑會導致離子細胞氧化壓力生成和粒線體損傷，並引起細胞凋亡，而抗氧化劑 NAC 可作為順鉑毒性的保護劑。Item 以斑馬魚為模式調查環境酸化與鉑類化療藥物對毛細胞與離子細胞的影響(2019) 洪君儀; Hung, Giun-Yi淡水生態系統的酸化已被認為是全球性的環境問題，並導致魚類行為的變化。然而，酸性環境是否造成淡水魚側線系統的功能改變仍然是未知的。此外，許多研究揭露藥物汙染水環境的事實，其中包括抗癌化療藥物。然而這些藥物造成的環境作用、環境影響的程度與廣度鮮為人知。本研究目的在於檢視斑馬魚胚胎暴露於酸性或鹼性淡水時，是否改變了神經丘毛細胞的表達和功能。並藉由決定鉑類化療藥物(順鉑)對於表皮離子細胞與毛細胞產生影響之最小濃度，了解順鉑之亞致死效應，以應用於鉑類藥物造成水環境影響之早期風險評估。將斑馬魚胚胎暴露於不同的酸鹼pH值環境中，分析長期暴露(受精後0~96小時)與短期暴露(受精後48~96小時)對胚胎形態與側線毛細胞功能之影響。另外，將斑馬魚胚胎受精後長期暴露於不同濃度的順鉑後，分析胚胎形態、存活率、體長、及魚體的離子(鈉、氯、鈣)與鉑含量。功能分析方面，利用掃描式離子選擇電極，分析側線毛細胞功能(機械傳導通道鈣離子流)與皮膚離子細胞排酸功能。結果顯示，長期暴露於pH5條件下，側線毛細胞數量與功能皆下降。短期暴露於pH5條件下，僅毛細胞功能下降，然而毛細胞數目不變。進一步利用morpholino oligonucleotides進行基因減弱，降低H+-ATPase與 gcm2 表現，使得調節酸鹼平衡機制受損後，發現胚胎毛細胞數量與功能皆下降。此外，胚胎長期暴露於濃度由低至高的順鉑中，毛細胞功能最先受損(濃度1 µM)、隨後是毛細胞數與魚體氯離子含量下降(濃度10 µM)、離子細胞排酸能力下降及魚體鈉與鈣離子含量下降(濃度50 µM)、體長與離子細胞密度下降(100 µM)、最後是存活率下降(濃度500 µM)。研究結果顯示酸性環境會導致神經丘毛細胞功能受損。對於順鉑引起之毒性，毛細胞明顯比離子細胞更敏感。本研究利用掃描式離子選擇電極偵測毛細胞與離子細胞功能之改變，決定順鉑最低影響濃度，此法有高達500倍相較於偵測存活率變化之敏感度，未來可應用於偵測鉑類藥物對於水環境造成之早期風險評估。Item 汞對於斑馬魚仔魚側線感覺與離子調節功能之影響(2018) 潘予芹; Pan, Yu-Chin汞（Hg）是一種具高毒性的重金屬，非常容易藉由生物累積的方式進入食物鏈。其毒性取決於他的化學結構、接觸途徑以及物種，目前已有許多在人體及哺乳類動物實驗中，證明長期暴露在汞確實會造成損傷，即使是在低濃度下仍有極高的風險。先前對於汞造成斑馬魚影響的研究相當多，主題大多著重在汞對於斑馬魚胚胎時期神經與腦部發育的影響，較少去探討孵化後仔魚暴露在含汞的環境下，其皮表的離子細胞以及毛細胞的影響。本實驗利用斑馬魚仔魚作為模式物種，分別暴露於短時間（4 hrs）與長時間（48 hrs）含汞（氯化汞、甲基汞）的水體當中，觀察仔魚表皮的毛細胞與離子細胞；這兩型細胞分別負責機械性感受器的功能、排酸功能。短時間暴露於氯化汞和甲基汞後，導致仔魚表皮之毛細胞與離子細胞的細胞數目與功能下降；進而觀察到仔魚逆流行為、活動力以及體內鈣和鈉含量下降。長時間暴露後，於較低的濃度即可觀察到汞所造成的影響，包括細胞數目與功能的下降、逆流行為、體內離子含量及基因表現量的改變。另外，於本實驗我們也觀察到氯化汞與甲基汞所造成的毒性不盡相同。Item 金屬奈米顆粒對斑馬魚仔魚的影響(2017) 方鏡雅; Fang, Ching-Ya近年來奈米科技日新月異，也成為炙手可熱的科技產業之一，但是我們也需要關注金屬奈米顆粒可能對環境及生物造成的風險，在過去的研究中大多是探討金屬奈米顆粒對動物的死亡率、胚胎發育、細胞染色觀察、行為測量、基因表現，較少有更深入的發現。本篇研究目的是利用斑馬魚仔魚為動物模式，探討奈米銅(CuNP)、奈米銀(AgNP)與傳統的金屬離子硫酸銅(CuSO4)、硝酸銀(AgNO3)對仔魚的傷害。主要利用掃描式離子選擇電極技術（SIET）測量細胞的功能，結果顯示毛細胞浸泡在CuSO4、CuNP、AgNO3和AgNP 4小時後，鈣離子流入量下降，而離子細胞的氫離子梯度顯著下降，這說明了毛細胞與離子細胞功能明顯下降。利用FM1-43 及Rhodamine123標定側線毛細胞、離子細胞，結果顯示仔魚浸泡CuSO4、CuNP、AgNO3和AgNP 4小時後，毛細胞數目顯著下降，而離子細胞密度顯著減少。利用qPCR定量分析離子細胞上參與排酸蛋白的基因，結果顯示仔魚浸泡CuSO4、CuNP、AgNO3、AgNP 24小時後，nhe3b的mRNA表現量有顯著提升，表示仔魚可能對Na+吸收與H+排出受到影響，所以SIET測量到H+排出減少可能與此有關。利用CellROX標定產生reactive oxygen species (ROS)的離子細胞，結果顯示離子細胞在CuSO4 (0.5 ppm)、CuNP ( ppm)、AgNO3 (50 ppm)和AgNP (0.1 ppm) ROS有顯著上升，這可能是造成細胞損傷的原因之一。仔魚浸泡在CuSO4、CuNP、AgNO3及AgNP 4小時後，逆流行為顯著下降，最大游泳速度結果顯示只有CuSO4 (0.5 ppm)、CuNP (0.5 ppm)組有顯著下降，在活動力的測量結果發現仔魚只有在AgNO3 (50 ppm) 及AgNP (1.5 ppm)有顯著降低。綜合以上結果證實CuNP、AgNP除了會造成行為異常、細胞產生ROS及基因表現量改變害之外，另外也發現細胞的功能有受到影響，然而金屬奈米顆粒造成細胞的傷害機制仍需進一步研究。