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Item 評估TrKB之潛力促效劑於阿茲海默氏症細胞與動物模式之神經保護效果(2019) 范家豪; Fan, Chia-Hao阿茲海默氏症(Alzheimer’s disease, AD)是目前最常見的神經退化性疾病之一，至今尚無顯著有效的治療方法。這種全球性的健康問題不論是對於個人或社會都有極大的影響。AD在病理學上主要有兩個病徵：類澱粉蛋白(β-amyloid peptides, Aβ)堆積成的斑塊(plaques)以及Tau蛋白過度磷酸化所導致的神經纖維糾結(neuro-fibrillary tangles, NFTs)。許多研究證實，在失智症病患腦中之腦源性神經滋養因子(Brain-derived neurotrophic factor, BDNF)濃度較低，且此現象可令更多的Aβ生成。BDNF及其受體原肌球蛋白相關激酶B(tropo-myosin-related kinase B, TrkB)，可調節長期增益效應(LTP)、長期抑制效應(long-term depre-ssion, LTD)、軸突出芽、樹突增生、突觸可塑性和神經元分化。7,8-二羥基黃酮(7,8-dihydroxyflavon, 7,8-DHF)是目前已知的TrkB促效劑，可與細胞膜上的TrkB受體結合並引發同源二聚化，啟動下游之訊息傳導。本研究是使用結構與7,8-DHF類似之12種新型的TrkB促效劑，經過MTT實驗評估發現12種促效劑對神經細胞都無明顯細胞毒性及神經突生長之影響。接著於小鼠海馬迴細胞初級培養給予Aβ25-35誘導神經損傷作為AD模式篩選平台，結果顯示LMDS-1能有效緩解因Aβ25-35寡聚體所導致的神經突長度及分支數目降低之現象，因此選擇LMDS-1進入動物實驗測試，並以7,8-DHF為正控制組。先利用立體定位注射Aβ25-35至小鼠海馬迴CA1區域以建立AD模式動物，再給予7,8-DHF或LMDS-1之處理，並於期間進行一系列行為實驗，結果顯示LMDS-1可有效改善因Aβ25-35誘導所導致的短期及長期記憶受損。在病理分析上，我們利用免疫組織化學染色和西方墨點法分析小鼠海馬迴組織，結果顯示LMDS-1可有效改善因Aβ25-35誘導所導致的Aβ堆積、成熟神經細胞缺失、pERK及synaptophysin表現量降低。由病理分析結果推論，LMDS-1可能是經由pY516TrkB活化Ras/MAPK路徑來激活CREB轉錄因子，進而上調mBDNF之表現量，改善因Aβ25-35所導致的記憶缺失。綜合上述結果，LMDS-1是具有治療AD潛力的新型TrkB促效劑，能夠改善動物記憶功能，並緩解AD代表性之病理特徵，希望能為日後AD研究提供一些新的方向與目標。Item PS128精神益生菌對於阿茲海默氏症小鼠模式的效益及其作用機制(2019) 陳潔玲; Chen, Jie-Ling隨著高齡社會的到來，失智症人數急遽增加，其中阿茲海默氏症是失智症中最常見的類型。大量的β類澱粉蛋白質(Aβ)與Tau蛋白質過度磷酸化堆積是阿茲海默氏症最主要的病理特徵，然而目前不論針對Aβ或是tau的處理仍無法有效治療方式；因此迫切需要開發新的治療策略以因應當前全球最棘手的阿茲海默氏症。依據腸腦(gut-brain axis)雙向影響的原理，先前研究發現口服益生菌可避免或是延緩因壓力或是腦室急性注射Aβ的方式造成認知功能的受損；然而其所使用的動物模式，都無法代表典型的阿茲海默氏症動物模式。另外，台灣本土發現的PS128精神益生菌可以減少因壓力產生的焦慮、憂鬱與周邊發炎反應等正向效果。因此本研究將使用偶發型與家族型兩種阿茲海默氏症動物模式探討PS128精神益生菌於認知功能的成效，進而探討其作用的分子機制。本研究將用6個月大的3×Tg-AD (三基因轉殖鼠)與C57BL/6J公鼠於側腦室急性注射STZ 4 μl (Streptozotocin; 鏈脲黴素)或是生理食鹽水，注射前7天起小鼠接受每天管餵一次PS128 100 μl (10^10 CFU/ml)或vehicle處理，連續給予33天。首先，我們發現3×Tg-AD小鼠相較於同齡的B6小鼠其空間學習能力較差，而且其膽鹼性神經元數量也大幅地減少。另外，我們也發現前處理PS128能避免B6或3×Tg-AD小鼠因急性側腦室注射STZ造成的認知功能缺陷並且伴隨著減少AD相關病理特徵，包括Aβ的堆積、神經發炎反應， BACE1蛋白質表現量上升與認知功能相關腦區神經元數量減損等，因此此研究揭露PS128益生菌對於阿茲海默氏症的治療潛力。Item 以BDNF受體TRKB為標的開發治療退化性神經疾病之小分子促效劑藥物-以阿茲海默氏症果蠅模式為平台(2019) 吳柏逸; Wu, Bo-Yi細胞外Aβ-澱粉樣蛋白（Aβ）形成斑塊和胞內含磷酸化Tau蛋白質的神經纖維纏結（Neurofibrillary tangle, NFT）是阿玆海默氏症（AD）的兩個主要病理特徵。許多研究證明干擾斑塊和/或NFT的發生將會有助AD的治療。經研究顯示腦源性神經營養因子（BDNF）參與AD的發病機制，因其在AD患者腦中的表現會降低，研究發現BDNF對Aβ42和tau毒性具有神經保護作用。我的研究目標是利用果蠅阿茲海默氏症的疾病模式：（1）研究BDNF信息傳遞路徑對AD致病機轉中的作用;（2）以AD果蠅模式篩選有助益的小分子TrkB促效劑，並（3）研究這些促效劑的作用方式。我們發現以RNA干擾果蠅BDNF受體TrkB同源蛋白（Toll 6和Toll 7）的表現，加劇了Aβ42誘導複眼粗糙的表型，也增加細胞死亡的數目，以及類澱粉斑的沉積。顯示BDNF信息傳遞路徑確實伴演Aβ42誘導神經毒性中有一定的角色，此結果也合理化使用果蠅模式篩選TrkB促效劑收治療阿玆海默氏症的策略。以類黃酮及TrkB促效劑類似化合物為篩選目標藥物，在我們初步的篩選中，7,8-DHF, Wogonin, LMDS1及LMDS4可改善因Aβ42造成果蠅複眼退化的性狀，同樣的包括上述的四種小分子藥物及LM016也對因TauR406W突變蛋白造成果蠅背甲剛毛缺失的性狀有改善，進一步發現7,8-DHF，Wogonin，LMDS1及LMDS4降低Aβ42毒性的效果，可因Toll 6和Toll 7的表現下降而減緩，顯示上述藥物有部分是透過BDNF訊息傳遞路徑來改善阿滋海默氏症的病徵，未來我們將以類似方式檢查，藥物壓制TauR406W蛋白毒性是否也是經由強化BDNF息傳遞路徑而來，實驗也將以細胞死亡的數目，類澱粉斑的沉積，及磷酸化Tau蛋白質的表現量，強化上述論証，此外藥物處理是否改變BDNF息傳遞路徑下游基因(如CREB及GSK3β) 的表現量，將有助釐清我們篩選的藥物是否為TrkB促效劑。Item PPP2R2B：外遺傳研究暨藥物篩檢模式的建立(2011) 王允麟; Yun-Lin WangProtein phosphatase 2A (簡稱PP2A)是細胞內重要的蛋白去磷酸化酵素，其次單元B調控PP2A在細胞內作用的位置及催化的受質種類。PPP2R2B是表現在腦神經細胞中的PP2A調控次單元B。腦部表現的PP2A調節tau蛋白的磷酸化。Tau蛋白過度磷酸化和PP2A活性下降，皆和阿茲海默氏症(AD)相關。本實驗室的研究亦發現PPP2R2B的低啟動子活性，和國人的阿茲海默氏症顯著相關。本研究第一部份是以PPP2R2B啟動子接上EGFP報導基因，來建立人類胚胎腎HEK-293及神經腫瘤SK-N-SH細胞，轉染入轉錄因子SP1及CREB1後，分析綠螢光量變化，並未呈現預期的調控情形。第二部分為探討PPP2R2B DNA甲基化的外遺傳調控，與阿茲海默氏症的相關性。選取五組年齡及性別配對的病人及正常人DNA樣品，經Bisulfite定序，結果發現AD病人的PPP2R2B的5'端甲基化程度有高於正常人的趨勢，尤其是-311及-310的位置，雖然並沒有到達顯著差異。進一步的神經(SK-N-SH、SH-SY5Y)及非神經(HEK-293)腫瘤細胞PPP2R2B啟動子定序，顯示HEK-293細胞PPP2R2B啟動子上的甲基化，但以去甲基化藥物5-aza-dC處理HEK-293後，PPP2R2B表現量並未顯著上升，MeCP2的抗體的染色質免疫沈澱亦未看到MeCP2蛋白結合到PPP2R2B啟動子上。Item PPP2R2B 基因外遺傳研究及細胞模式研究(2010) 高慈蓬PP2A為真核細胞內一種普遍的絲胺酸/酥胺酸去磷酸酶。PP2A全酶包含結構骨架A次單位、調節B次單位、催化C次單位。PPP2R2B (Bβ)為普遍表現在大腦組織中的調控次單位。PPP2R2B基因透過基因啟動子的差異使用及選擇性裁接，產生Bβ1和Bβ2兩種異構型蛋白。Bβ1啟動子上CAG三核苷酸重複擴增，可能因導致細胞質中Bβ1表現量的上升，而與第十二型脊髓小腦萎縮症相關。相反的，病例-對照組及啟動子的研究顯示，罕見短的CAG三核苷酸重複等位基因和低轉錄活性及阿茲海默氏症相關。為探討Bβ1在阿茲海默氏症上可能扮演的角色，本研究透過bisulfite處理及選殖定序，檢查5個阿茲海默氏症患者及年齡與性別配對的正常人，Bβ1啟動子1 kb片段的序列甲基化情形，結果發現患者的甲基化程度略高於正常人(雖然差異未達顯著性)，顯示外遺傳改變可能影響阿茲海默氏症患者Bβ1的表現。此外，本研究並用穩定誘導表現Myc標籤的Bβ1及Bβ2細胞株，來探討Bβ調節的PP2A在神經退化中的角色。結果發現表現Bβ2的細胞活性氧自由基增加。氧化劑TBH及Aβ1-40的添加更顯著提昇Bβ2表現細胞的活性氧自由基。Item 脊髓小腦萎縮症第十七型及阿茲海默氏症神經保護中草藥的研究(2017) 黃頂翔; Huang, Ding-Siang多麩醯胺（PolyQ）介導的神經退行性疾病是由各種蛋白質的多麩醯胺擴增引起的。而脊髓小腦萎縮症第十七型（SCA 17）是由TATA盒結合蛋白（TATA box-binding protein, TBP）基因中CAG / CAA重複擴增引起的多麩醯胺疾病。銀杏葉提取物EGb 761含有黃酮和萜類化合物，可用於治療神經退化性疾病如阿茲海默氏症與帕金森氏病。雖然EGb 761的神經保護作用的功能已經被證實，但是EGb 761對於治療SCA 17是否具有效果則尚不清楚。為解決此一問題，我們利用表達TBP/79Q的SH-SY5Y細胞，以及具有人類突變型TBP基因的SCA17轉基因小鼠進行實驗。我們的研究成果發現利用EGb 761處理TBP/79Q-SH-SY5Y細胞後，細胞內十二烷基硫酸鈉不溶性蛋白質的含量會明顯減少；我們進一步發現，EGb 761處理可以抑制TBP/79Q-SH-SY5Y細胞的興奮性毒性以及鈣離子流入，並且降低經麩醯胺酸鹽處理SH-SY5Y神經母細胞瘤細胞的細胞凋亡標誌物表達。活體實驗中，我們每天利用腹腔內注射EGb 761（100 mg/kg）給予SCA 17轉基因小鼠，實驗結果發現EGb761可以有效緩解SCA 17轉基因小鼠的運動缺陷。由上述研究結果提供證據證實利用SCA 17的細胞與轉基因小鼠模型，EGb 761可以通過抑制神經細胞的興奮性毒性和細胞凋亡來達到治療SCA 17的效果。為此，我們認為EGb 761可能是有效治療SCA 17的潛在治療藥物。除罕見的遺傳性SCA 17外，阿茲海默氏症（AD）是最常見的神經退化性疾病，AD特徵在於受影響腦區域中形成澱粉樣蛋白-β肽的胞外斑塊，以及細胞內微管相關蛋白tau因為過度磷酸化聚集形成的神經原纖維纏結。在本研究中，我們探討X蛋白質對於乙型類澱粉蛋白聚合的影響，我們也發現綠茶內的其中一種茶多酚，Epigallocatechin gallate (EGCG) 能抑制X蛋白質對於乙型類澱粉蛋白的聚合作用，亦能增加細胞存活率。此外經過EGCG處理的三重轉基因AD小鼠（h-APPSwe，h-tauP301L和h-PS1M146V），通過Morris水迷宮、Y迷宮和新穎的對象識別的動物行為測試實驗，發現轉基因AD小鼠的記憶學習均獲得顯著的改善。因此，我們認為EGCG可能透過抑制X蛋白質而有效治療AD的多功能潛在治療藥物。Item 遺傳背景對於阿茲海默氏症模式小鼠之影響(2019) 柯雅云; Ko, Ya-Yun阿茲海默氏症為一種最常見的失智症，分為兩種類型：早發性的家族遺傳型阿茲海默氏症(Familial Alzheimer’s disease, FAD)及晚發性的偶發型阿茲海默氏症(Sporadic Alzheimer’s disease, SAD)。家族遺傳型阿茲海默氏症是因為基因的突變所導致，如：類澱粉蛋白前驅蛋白(amyloid precursor protein, APP)、早老素(Presenilin-1, PS1、Presenilin-2, PS2)的突變；而偶發型阿茲海默氏症可能受環境、飲食習慣、壓力及年紀等因素影響。阿茲海默氏症主要的病徵有β類澱粉蛋白(Aβ)堆積在細胞外形成類澱粉斑塊，及tau蛋白過度磷酸化導致神經細胞內的神經纖維糾結，而這些最終都會導致神經細胞的死亡。在過去幾十年，臨床的實驗只能夠延緩阿茲海默氏症病程的發展，卻無法有效的治療這個疾病。良好的動物模式對於實驗的進行是十分重要的，但在實驗室以往的經驗中我們發現B6.129-Psen1tm1Mpm Tg (APPSwe, tauP301L) 1Lfa/J這種3基因轉殖鼠所顯現的性狀並不明顯，而且不容易準備相同遺傳背景的野生鼠作為實驗控制組。為了要有一個更具代表性的實驗動物，我們將此基因轉殖鼠的品系從B6.129雜交品系回交配成B6的純品系，並以行為實驗進行B6純品系3基因轉殖小鼠短期記憶、長期記憶、焦慮、運動能力的評估。我們發現B6.129雜交3基因轉殖小鼠不論在6、9、12、18月大，運動能力都顯著低於野生型B6小鼠及B6純品系 3基因轉殖小鼠，而B6純品系 3基因轉殖小鼠與野生型B6小鼠之間沒有顯著的差異，但在焦慮行為測試中顯示B6.129雜交鼠較無焦慮情形。另外利用西方墨點法測量小鼠海馬迴各種蛋白質的表現量，我們發現12月大B6.129雜交3基因轉殖小鼠及18月大B6純品系3基因轉殖小鼠則在Aβ的表現量相較於野生型小鼠有顯著的上升。Tau蛋白的表現量及202、396位點磷酸化程度則是兩種品系的3基因轉殖小鼠從6月大起都顯著的高於野生型小鼠，而腦片染色結果也可以發現B6純品系3基因轉殖小鼠及B6.129雜交3基因轉殖小鼠從9個月大開始其Tau蛋白202位點的螢光強度就顯著的高於野生型小鼠。除此之外，在檢查多種磷酸化Tau蛋白的激酶後我們發現12及18月大B6品系的3基因轉殖小鼠pERK的表現量顯著的高於野生型及B6.129雜交3基因轉殖小鼠，我們發現pERK的訊號與NeuN的訊號有共表現的狀況，確認ERK的活化是在神經細胞中，因此我們認為Tau蛋白的磷酸化可能是經由ERK活化所引起的。而利用腦片染色方式檢測小鼠腦中Iba1及GFAP數量發現三組小鼠間微膠細胞及星狀膠細胞數量差異不大，因此我們認為B6純品系3基因轉殖小鼠及B6.129雜交3基因轉殖小鼠沒有膠細胞過度增生的情況。我們在行為測試中發現B6.129雜交3基因轉殖小鼠發病情形較為嚴重，但在蛋白質含量測試上發現B6品系3基因轉殖小鼠tau磷酸化程度較高。因此，未來需要進一步確認B6品系3基因轉殖小鼠在阿茲海默氏症上研究的可行性。Item 中草藥山楂的有效成分抑制阿茲海默氏症新的生物標誌Protein-X增加Amyloid-β毒性之研究(2017) 蔡志誠; Tsai, Chih-Chen阿茲海默症 (Alzheimer’s disease) 是一種常見的神經退化性疾病，它的病理特徵主要有神經細胞的變性，蛋白質斑塊堆疊和神經纖維的纏繞。有許多的證據指出造成阿茲海默症最主要的病因是β類澱粉蛋白 (Aβ) 的堆疊。在人類的大腦當中，類澱粉蛋白會從小分子的單體 (monomers) 慢慢堆疊到低聚物 (oligomers)、纖維化 (fibrils)、最後變成斑塊 (plaques)。從以前的文獻中有指出Aβ的低聚合物比起其他的蛋白質型態是最具有毒性的，因此本研究是希望能從中草藥當中找出可以有效減少Aβ斑塊堆疊的小分子物質(SM-X) 進而減少Aβ的低聚合物。 本實驗室，目前已經發現Protein-X在年老的阿茲海默症老鼠當中比起年輕的小鼠有更多的表現而且伴隨著更多類Aβ低聚合物的堆疊。由建立Protein-X stably transfected 的細胞株中，在細胞存活度和西方墨點法的實驗中，可以看出有持續表現蛋白X的細胞中被外加的Aβ刺激之後會產生更多Aβ的聚集進而導致細胞的存活度降低，而從中藥萃取出的SM-X不僅能夠降低蛋白X所刺激出的 Aβ，也藉由此現象來達到拯救細胞的效果;因此，SM-X是一種能夠成為治療阿茲海默症的潛力藥物。Item 黨參之有效化合物(C-9)降低由Protein-X誘發之類澱粉蛋白細胞毒性及蛋白寡聚合之機轉探討(2017) 林晨揚; Lin, Chen-Yang阿茲海默氏症(Alzheimer's disease, AD)是最常見的神經退化性疾病之一，好發於65歲以上的老年人口，阿茲海默氏症主要是由β-類澱粉蛋白(amyloid beta, Aβ)堆積形成類澱粉斑塊(amyloid plaques)和過度磷酸化Tau蛋白(p-tau)造成的神經纖維糾結導致神經細胞的損傷。先前研究顯示，Aβ會聚集形成不同的型態(forms)，其中寡聚類澱粉蛋白(Aβ oligomer)具有較高的毒性。所以發展具有抑制Aβ聚集(aggregation)的藥物是治療阿茲海默氏症的策略之一。在我們先前的實驗中發現，兩年大的阿茲海默氏症模式鼠中，具有較高表現的Protein-X。為了確認Protein-X在阿茲海默氏症中的機制，我們建立了Protein-X stable transfected SH-SY5Y的細胞株。發現Protein-X表現的情況下，細胞產生較高的細胞毒性之寡聚合Aβ聚集(Aβ oligomerization)。我們也在黨參中發現化合物9(C-9)，可以降低細胞毒性及寡聚合Aβ的聚集。故是發展治療阿茲海默氏症藥物的潛力藥物。Item 以神經微膠細胞發炎反應為標的之阿茲海默氏症治療策略(2017) 謝育軒; Hsieh, Yu-Hsuan阿茲海默氏症是常見的漸進性神經退化性疾病，主要病理特徵包括細胞外間質的β類澱粉樣纖維(Aβ fibril)堆積，及細胞內高度磷酸化tau形成的神經纖維糾結。目前對於阿茲海默氏症致病機制仍未完全了解，患者也無法被完全治癒，因此發展阿茲海默氏症的治療策略是相當重要的。近年研究顯示神經發炎反應在阿茲海默氏症上扮演重要的角色，因此抑制神經發炎反應已成為治療阿茲海默氏症的重要標的。與發炎反應相關的微膠細胞是中樞神經的免疫細胞，具有典型的M1 (發炎反應)及替代的M2 (免疫抑制)兩種活化路徑，因此調節微膠細胞活化狀態已被認為是治療神經發炎性疾病的策略。先前本實驗室於脂多醣(LPS)刺激的RAW264.7小鼠巨噬細胞實驗，發現化合物VB-030、037能降低一氧化氮(NO)、TNF-α、IL-1β、PEG2等發炎因子的釋放。延續此發現，本研究首先利用LPS或β類澱粉樣纖維刺激BV-2微膠細胞模式，探究化合物VB-030、037的抗發炎能力，結果發現VB-037能顯著降低LPS/β類澱粉樣纖維刺激BV-2細胞之NO及Iba1蛋白表現，表示VB-037具有抗β類澱粉樣纖維誘導細胞發炎的潛力，同時也利用小鼠發炎抗體矩陣(Mouse inflammation antibody array)揭示VB-037之抗發炎標的IL-1α，並利用西方轉漬分析證實VB-037能顯著降低活化之BV-2細胞之促發炎因子IL-1α。為了測試VB-037對於神經細胞的保護效果，我們利用受發炎刺激之BV-2細胞制約培養液或共處理發炎因子LPS與IFN-γ，建構誘導表現Aβ-GFP融合蛋白的人類SH-SY5Y神經母細胞瘤細胞發炎模式，實驗結果發現VB-037能提升表現Aβ-GFP融合蛋白的SH-SY5Y之細胞存活率，降低細胞損傷後之乳酸脫氫酶(LDH)釋放量，並促進神經突生長，同時前處理VB-037能降低受LPS與IFN-γ刺激之SH-SY5Y細胞IL1A及磷酸化P38 (T180/Y182)、JNK (T183/Y185)、JUN (S63、S73)蛋白表現量。綜合本研究的發現，VB-037具有抗β類澱粉樣纖維誘導之神經發炎作用及神經保護作用，有潛能發展為抗β類澱粉樣纖維誘導神經發炎之新穎藥物。