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Association of TNF-α gene with spontaneous deep intracerebral hemorrhage in the Taiwan population: a case control study
(2010-06-10) Chen, Yi-Chun; Hu, Fen-Ju; Chen, Phoebe; Wu, Yih-Ru; Wu, Hsiu-Chuan; Chen, Sien-Tsong; Lee-Chen, Guey-Jen; Chen, Chiung-Mei
Abstract Background Genetic factors may play a role in susceptibility to spontaneous deep intracerebral hemorrhage (SDICH). Previous studies have shown that TNF-α gene variation was associated with risks of subarachnoid hemorrhage in multiple ethnicities. The present case-control study tested the hypothesis that genetic variations of the TNF-α gene may affect the risk of Taiwanese SDICH. We examined the association of SDICH risks with four single nucleotide polymorphisms (SNPs) within the TNF-α gene promoter, namely T-1031C, C-863A, C-857T, and G-308A. Methods Genotyping was determined by PCR-based restriction and electrophoresis assay for 260 SDICH patients and 368 controls. Associations were tested by logistic regression or general linear models with adjusting for multiple covariables in each gender group, and then in combined. Multiplicative terms of gender and each of the four SNPs were applied to detect the interaction effects on SDICH risks. To account for the multiple testing, permutation testing of 1,000 replicates was performed for empirical estimates. Results In an additive model, SDICH risks were positively associated with the minor alleles -1031C and -308A in men (OR = 1.9, 95% CI 1.1 to 3.4, p = 0.03 and OR = 2.6, 95% CI 1.3 to 5.3, p = 0.005, respectively) but inversely associated with -863A in females (OR = 0.5, 95% CI 0.2 to 0.9, p = 0.03). There were significant interaction effects between gender and SNP on SDICH risks regarding SNPs T-1031C, C-863A, and G-308A (p = 0.005, 0.005, and 0.007, respectively). Hemorrhage size was inversely associated with -857T in males (p = 0.04). Conclusions In the Taiwan population, the associations of genetic variations in the TNF-α gene promoter with SDICH risks are gender-dependent.
DRP1表現變異和帕金森症：啟動子多型性和轉錄調控研究
(2020) 張林康; Cheung, Lam-Hong
在帕金森症(PD)中，粒線體的代謝被破壞，而抑制電子傳遞鏈複合物I的神經毒素在人類和動物模型中會產生類似於帕金森氏症的症狀。遺傳性帕金森氏症的連鎖分析也顯示粒線體功能障礙與帕金森症的發病相關。粒線體在細胞中以動態管狀網絡存在，它通過裂變和融合不斷改變形狀，來適應局部的環境改變。Dynamin-related protein 1 (DRP1)是控制粒線體分裂的關鍵蛋白，它會經過轉譯後修飾和移位至粒線體外膜，來調節粒線體分裂。先前60個帕金森症患者週邊血單核細胞的研究顯示，DRP1表現水平顯著較53個正常對照組上升。DRP1啟動子的遺傳變異可能調節DRP1表達。通過直接定序，發現在DRP1啟動子區域中有-556 G/A (rs565216693)、-318 -/AAT、-315 A/T (rs201231372)和-311 A/T (rs11423175)等核苷酸多型性。接著藉PCR-RFLP技術，對533個帕金森症患者和544個正常對照組的病例對照研究，確認了-556 G/A多型性與帕金森症相關。-311 A/T與連鎖的-318 -/AAT及-315 A/T多型性與帕金森症相關性，DRP1啟動子直接定序檢測了各63個帕金森症患者和正常人的樣品，但因樣品數不夠大，差異未達顯著性。經由電腦模擬搜尋上述多型性鄰近區域序列，發現-556位點的變異會影響轉錄因子TFAP2A (Transcription factor AP-2 alpha)、CEBPB (CCAAT enhancer binding protein beta)的結合，而-318、-311位點的變異會影響轉錄因子FOXA1 (Forkhead box A1)的結合。TFAP2A、CEBPB、FOXA1在人的神經組織中皆有表現。-556 G/A可能因影響TFAP2A的結合而影響DRP1表現，-318 -/AAT、-311 A/T則可能因移動FOXA1結合位置改變染色質重建(Chromatin remodeling)，來影響DRP1表現。過度表現FOXA1或CEBPB於SHSY-5Y細胞，可增強內生性DRP1表現。共轉染對照組DRP1-GFP報導質體和FOXA1/CEBPB到SHSY-5Y細胞，GFP的轉錄活性增加。本研究表明了-556 G/A基因型的人患上帕金森症的風險較大，且在SHSY-5Y細胞中，轉錄因子FOXA1或CEBPB會増加DRP1的轉錄活性。
Spinocerebellar ataxia type 8 larger triplet expansion alters histone modification and induces RNA foci
(2009) Chen, I-Cheng; Lin, Hsuan-Yuan; Lee, Ghin-Chueh; Kao, Shih-Huan; Chen, Chiung-Mei; Wu, Yih-Ru; Hsieh-Li, Hsiu-Mei; Su, Ming-Tsan; Lee-Chen, Guey-Jen
中草藥及天然或合成化合物對阿茲海默氏症細胞與動物模式的治療效用
(2018) 邱雅貞; Chiu, Ya-Jen
阿茲海默氏症(AD)是有關漸進性認知衰退和記憶力喪失的疾病，也是最常見的一種老人痴呆症，病理學上病徵之一是由 β-澱粉樣 (Aβ)沉積物組成的老年斑。研究發現，腦中的 Aβ 堆積會造成氧化壓力和發炎損傷，進而導致神經細胞凋亡及認知功能失調。有鑑於此，尋找可能減少 Aβ 聚集的方法，可能有效治療 AD。本研究檢視中藥脹果甘草(G. inflata)及其活性成分甘草查爾酮 A (Licochalcone A)、甘草素(Liquiritigenin)，和本校化學系姚清發老師提供的合成化合物 NC009-1，抑制 Aβ 聚集的情形及神經保護性。誘導性 Aβ-GFP 293 細胞、硫黃素 T (Thioflavin T)或 DPPH 清除自由基試驗結果顯示，脹果甘草/活性成分和 NC009-1，皆可抑制 Aβ 蛋白聚集和相關聯的氧化壓力。此外，LPS/IFN-γ 刺激發炎的小鼠 BV-2 微膠細胞試驗顯示，脹果甘草/活性成分可減少 BV-2 的發炎反應，來達到抗發炎的效果。另外，誘導性 Aβ-GFP SH-SY5Y 細胞試驗結果顯示，脹果甘草/活性成分和 NC009-1 可抑制乙醯膽鹼酶(acetylcholinesterase) 活性、增強 SOD2 表現、及/或促進神經突生長。為瞭解脹果甘草/活性成分和 NC009-1 對細胞保護的分子機制，以抗體或 PCR 矩陣，檢測 Aβ-GFP SH-SY5Y 細胞中，與細胞凋亡相關蛋白或阿茲海默氏症相關基因的表現。結果發現，脹果甘草/活性成分可減緩 BCL2 的下降，並減低 IGFBP2 的上升、凋亡蛋白酶 3 的切割、BAD 及 BAX 的量，來保護 Aβ-GFP SH-SY5Y 細胞免於 BV-2 制約培養液誘導的細胞死亡。然而 NC009-1 在 Aβ-GFP SH-SY5Y 細胞中，可正調控 APOE 和 TRKA 的表現。在鏈脲佐菌素(Streptozocin)誘導高血糖的 PS1M146V、APPSwe 和 TauP301L 三基因(3×Tg) AD 轉殖鼠的實驗中， NC009-1 並可挽救 APOE 和 TRKA 的減少，降低海馬迴及腦皮層中 Aβ 及 Tau 的量，及減緩認知缺失。這些研究結果指出，脹果甘草/ 活性成分與 NC009-1 可能作為 AD 的治療策略。
中藥複方製劑芍藥甘草湯和Coumarin-chalcone衍生物在Tau蛋白易聚集表現之阿茲海默氏症細胞模式中之療效
(2022) 林德嫻; Lin, Te-Hsien
阿茲海默氏症(Alzheimer’s disease, AD)為一種進行性且不可逆的神經退化性疾病，受損的記憶和認知能力會逐漸失常最終造成身體功能的完全喪失。AD病人腦中最主要的特徵為不正常的Amyoild β與Tau蛋白聚集形成的老化斑塊(Senile plaque)和神經纖維纏結(Neurofibrillary tangles)。神經纖維纏結主要組成是高度磷酸化的Tau蛋白，而Tau蛋白的病變不僅在AD病人，也在許多Tauopathy中見到。在大腦中由於錯誤折疊形成的蛋白堆積，引發許多病理事件，例如氧化壓力、神經發炎，或是與神經細胞功能相關的訊息傳遞障礙，降低神經細胞存活。本篇研究主要是利用人類胚胎腎細胞HEK-293和神經纖維瘤母細胞SH-SY5Y，表現易聚集特性的ΔK280 TauRD片段蛋白，作為評估中藥製劑芍藥甘草湯(SG-Tang)以及Coumarin-chalcone衍生物LM-021、LM-031和LMDS-1~4化合物，抑制蛋白聚集、抗氧化和神經保護性的情形。芍藥甘草湯製劑，由甘草與白芍以等比例製成，除了可有效降低以LPS/IFN-γ刺激後活化的BV-2微膠細胞所釋出的NO、TNF-α、IL-1β及IL-6等前驅發炎細胞因子外，並可抑制由於誘導表現ΔK280 TauRD蛋白而上升的BAD、BID、CASP3、CASP8和CYCS表現，來達到Tau蛋白聚集抑制和神經保護性。其中LM-021除了本身有化學伴護活性可直接抑制ΔK280 TauRD的聚集外，還可透過PKA、CaMKII、ERK等路徑活化CREB和下游的BDNF、BCL2表現，來展現其神經保護之功能。接著在ΔK280 TauRD-DsRed SH-SY5Y細胞中，觀察到LM-031可提升HSPB1伴護蛋白表現以降低Tau蛋白的錯誤折疊，以及藉由活化NRF2/NQO1/GCLC和CREB調控之BDNF/AKT/ERK/BCL2路徑，來達到抑制細胞凋亡和促進細胞存活之效果。最後，因LM-031可提升CREB依存的BDNF表現，利用虛擬篩選找出LM-031類似化合物LMDS-1~4，並進一步以TRKB與ligand作用的d5-domain (PDB 1hcf)，以分子模擬計算LM-031類似化合物與此蛋白片段的結合構形。細胞實驗結果顯示，LMDS-1和LMDS-2可經由TRKB/ERK和TRKB/PI3K/AKT訊息路徑，增加CREB磷酸化及其下游BDNF、BCL2基因表現。總結來說，本研究結果顯示芍藥甘草湯的抗氧化和抗發炎活性，可抑制神經細胞凋亡，在Tau蛋白聚集的細胞中展現其神經保護的能力，而Coumarin-chalcone衍生物LM-031、LM-021、LMDS-1、LMDS-2，具有活化HSPB1、NRF2及/或TRKB的作用，來降低Tau蛋白的錯誤摺疊、抑制細胞凋亡和促進神經細胞存活。以上這些研究結果顯示了芍藥甘草湯和Coumarin-chalcone衍生物，應用在AD治療上的潛能。
以促進BDNF-TRKB訊息傳遞路徑作為阿茲海默氏症治療策略的ΔK280 TauRD-DsRed SH-SY5Y細胞模式分析
(2020) 蔣妮霓; Chiang, Ni-Ni
阿茲海默氏症(Alzheimer’s disease, AD)是一種漸進性神經退行性疾病，最常見的臨床症狀是記憶力衰退及認知功能下降。阿茲海默氏症的病理學特徵為大腦中含有Amyloid β (Aβ)聚集形成的類澱粉斑塊，以及過度磷酸化的Tau蛋白形成的神經纖維糾結(Neurofibrillary tangle, NFT)。神經營養因子腦源性神經滋養因子(Brain-derived neurotrophic factor, BDNF)結合在受體型酪胺酸激酶B (Tropomyosin-related kinase B, TRKB)上時，會活化下游訊息傳遞路徑，最終磷酸化環磷腺苷效應元件結合蛋白1 (cAMP responsive element binding protein 1, CREB)，來促進神經元存活和神經可塑性。臨床研究發現阿茲海默氏症病人的海馬迴及皮層中，BDNF蛋白或mRNA的表現量降低。小分子TRKB促效劑7,8-DHF (7,8-二羥基黃酮)可改善AD小鼠認知功能且抑制海馬迴突觸喪失，顯示促進TRKB訊息傳遞，為阿茲海默氏症有潛能的治療策略。本研究使用誘導表現ΔK280 TauRD-DsRed的人類SH-SY5Y細胞，檢測7,8-DHF及Wogonin (黃芩素)、DHFS-1 (即Quercetin槲皮素)、DHFS-2、Kaempferol (山奈酚)、Apigenin (芹菜素)等類似物的神經保護作用。在測試的黃酮類化合物中，7,8-DHF、DHFS-1、Apigenin可增加表現ΔK280 TauRD-DsRed細胞中，DsRed的螢光通量。處理7,8-DHF、DHFS-1、Apigenin可以使細胞內熱休克蛋白HSPB1表現增加，並增加ΔK280 TauRD-DsRed融合蛋白的可溶性，但不影響融合基因的mRNA表現量。另外， 7,8-DHF、DHFS-1、Apigenin的處理，可顯著降低內活性氧化物的生成及凋亡蛋白酶1活性，並增加NRF2轉錄因子的表現及促進神經突生長，但僅Apigenin可降低乙醯膽鹼酯酶活性。進一步的TRKB訊息傳遞路徑分析顯示，處理7,8-DHF、DHFS-1、Apigenin後，ΔK280 TauRD-DsRed細胞內p-TRKB (Y817)、p-ERK (T202/Y204)、p-CREB (S133)、BCL2蛋白表現顯著增加，並伴隨著凋亡調節蛋白BAX的顯著降低。以TRKB的RNA干擾(RNAi)作用靜默TRKB基因表現後，可抑制7,8-DHF、DHFS-1、Apigenin的促進神經突生長。本7,8-DHF及其類似物做為TRKB促效劑的研究，可提供阿茲海默氏症新的治療策略。
以神經微膠細胞發炎反應為標的之阿茲海默氏症治療策略
(2017) 謝育軒; Hsieh, Yu-Hsuan
阿茲海默氏症是常見的漸進性神經退化性疾病，主要病理特徵包括細胞外間質的β類澱粉樣纖維(Aβ fibril)堆積，及細胞內高度磷酸化tau形成的神經纖維糾結。目前對於阿茲海默氏症致病機制仍未完全了解，患者也無法被完全治癒，因此發展阿茲海默氏症的治療策略是相當重要的。近年研究顯示神經發炎反應在阿茲海默氏症上扮演重要的角色，因此抑制神經發炎反應已成為治療阿茲海默氏症的重要標的。與發炎反應相關的微膠細胞是中樞神經的免疫細胞，具有典型的M1 (發炎反應)及替代的M2 (免疫抑制)兩種活化路徑，因此調節微膠細胞活化狀態已被認為是治療神經發炎性疾病的策略。先前本實驗室於脂多醣(LPS)刺激的RAW264.7小鼠巨噬細胞實驗，發現化合物VB-030、037能降低一氧化氮(NO)、TNF-α、IL-1β、PEG2等發炎因子的釋放。延續此發現，本研究首先利用LPS或β類澱粉樣纖維刺激BV-2微膠細胞模式，探究化合物VB-030、037的抗發炎能力，結果發現VB-037能顯著降低LPS/β類澱粉樣纖維刺激BV-2細胞之NO及Iba1蛋白表現，表示VB-037具有抗β類澱粉樣纖維誘導細胞發炎的潛力，同時也利用小鼠發炎抗體矩陣(Mouse inflammation antibody array)揭示VB-037之抗發炎標的IL-1α，並利用西方轉漬分析證實VB-037能顯著降低活化之BV-2細胞之促發炎因子IL-1α。為了測試VB-037對於神經細胞的保護效果，我們利用受發炎刺激之BV-2細胞制約培養液或共處理發炎因子LPS與IFN-γ，建構誘導表現Aβ-GFP融合蛋白的人類SH-SY5Y神經母細胞瘤細胞發炎模式，實驗結果發現VB-037能提升表現Aβ-GFP融合蛋白的SH-SY5Y之細胞存活率，降低細胞損傷後之乳酸脫氫酶(LDH)釋放量，並促進神經突生長，同時前處理VB-037能降低受LPS與IFN-γ刺激之SH-SY5Y細胞IL1A及磷酸化P38 (T180/Y182)、JNK (T183/Y185)、JUN (S63、S73)蛋白表現量。綜合本研究的發現，VB-037具有抗β類澱粉樣纖維誘導之神經發炎作用及神經保護作用，有潛能發展為抗β類澱粉樣纖維誘導神經發炎之新穎藥物。
使用Aβ折疊報告細胞篩選靶向ERK及AMPK/EEF2K訊息的合成化合物作為新穎阿茲海默症治療策略
(2023) 祁舜慈; Chi, Shun-Tzu
阿茲海默症(Alzheimer’s disease, AD)是一種與年齡相關的神經退化性疾病，會逐漸的破壞記憶力以及學習能力，其主要病理特徵有大腦中β-澱粉樣蛋白(Aβ)堆積形成的斑塊，以及過度磷酸化tau蛋白所形成的神經纖維纏結。其中Aβ的堆積會損害神經元的突觸可塑性、增加細胞內的活性氧物質，並對神經元造成損害，因此開發AD藥物的其中一種方法，便是防止Aβ的堆積或阻斷Aβ寡聚體的神經毒性。研究有發現，在AD患者的CA1腦區中，編碼核糖體蛋白的基因受到異常的調節，其中與蛋白質的合成有關的真核延伸因子2 (Eukaryotic elongation factor 2, EEF2)在AD疾病中出現下調。EEF2在神經元的存活中起到重要的作用，可維持突觸可塑性。在真核細胞轉譯的過程中，EEF2的活性受到嚴格的控管。真核延伸因子2激酶(Eukaryotic elongation factor 2 kinase, EEF2K)藉磷酸化EEF2的T56位點抑制其活性，來調控轉譯的過程。EEF2K的活性受多種訊息路徑調控，如AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)及細胞外訊息調節激酶(Extracellular-signal regulated kinase, ERK)。AMPK的訊息傳導可透過磷酸化S398位點來活化EEF2K，促使EEF2磷酸化失活，從而減少蛋白質合成；而ERK可透過磷酸化S366位點來抑制EEF2K的活性，使EEF2去磷酸化活化，來促進蛋白質的合成，如：腦源性神經營養因子(Brain-derived neurotrophic factor, BDNF)。本論文利用Aβ折疊報導細胞Aβ-GFP SH-SY5Y細胞，探究吲哚衍生物(Indole derivatives: NC009-1, -3, -6, -11)及香豆素衍生物(Coumarin derivatives: LM-016, -021, -022, -036)，改善Aβ錯誤折疊的情形及神經保護作用。在八種測試的化合物中，除NC009-3外，所有化合物均符合Lipinski預測口服生物利用度的標準。根據計算出的極性表面積和血腦屏障滲透評分，八種化合物皆被預測為可滲透血腦屏障。所檢測的化合物皆可改善Aβ的錯誤折疊以及相關的氧化壓力。此外，前處理NC009-1、NC009-6及LM-021、LM-036可有效降低凋亡蛋白酶-3/6以及抑制乙醯膽鹼酯酶(Acetylcholinesterase, AChE)的活性，並促進神經突生長。接下來，為了解化合物促進細胞中蛋白質合成之作用機制，使用嘌呤酶素標定的轉譯的表面傳感(Surface sensing of translation, SUnSET)分析法，發現NC009-1、LM-021及LM-036的處理可增加細胞中新合成的蛋白質。此外，NC009-1增加了p-ERK (T202/Y204)和p-EEF2K (S366)的表達，LM-021降低了p-AMPK (T172)和p-EEF2K (S398)的表達，而LM-036同時作用於兩條途徑，增加EEF2K的S366磷酸化並減少S398磷酸化，從而導致EEF2K活性降低。隨後對應的p-EEF2 (T56)抑制活性的降低，增強了p-CREB (S133)及其下游BDNF、BCL2蛋白的表達，並促進神經突生長。研究結果可作為開發新穎且有潛能的阿茲海默症治療策略的參考。
利用Aβ折疊報導細胞篩選黃酮及香豆素衍生物作為促效劑標的BDNF受體TRKB的阿茲海默症治療策略
(2021) 黃鏡嘉; Huang, Ching-Chia
阿茲海默症(AD)是與記憶缺陷和認知功能下降相關的進行性神經退行性疾病。病理學上AD的特徵是大腦中存在澱粉樣蛋白β (Aβ)聚集體(澱粉樣斑塊)和由高磷酸化的Tau蛋白形成的神經原纖維纏結(NFT)。腦源性神經營養因子(BDNF)是神經營養蛋白家族的成員，以高親和力與原肌球蛋白相關的受體激酶B (TRKB)結合，活化下游信號傳導，來促進神經元的存活、分化和神經可塑性。已經發現AD患者的腦中BDNF和TRKB表達水平降低，並且BDNF降低和TRKB受損導致AD中的神經變性。AD小鼠模型的海馬迴中施用TRKB特異性促效劑7,8-二羥基黃酮(7,8-DHF)，可改善了空間記憶並降低樹突損傷，表明TRKB信號傳導增強，為有希望的AD治療策略。本研究使用表達Aβ-GFP的人類神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞，對15種黃酮和香豆素衍生物，進行Aβ聚集抑制性及神經保護性的評估。在測試的化合物中，ZN006、ZN013、ZN014、ZN015可抑制Aβ蛋白聚集、降低活性氧化物(ROS)、及抑制乙醯膽鹼脂酶(Acetylcholinesterase)活性，其中ZN014、ZN015並能抑制凋亡蛋白酶-1 (Caspase-1)活性及促進神經突生長(Neurite outgrowth)。在TRKB訊息傳遞路徑上，ZN014、ZN015可透過TRKB受體的Y516、Y817磷酸化，及下游ERK激酶T202/Y204磷酸化、AKT激酶S473磷酸化的活化，進一步促進轉錄因子CREB的S133磷酸化，來增強神經營養因子BDNF及抗凋亡蛋白BCL2的表現。RNA干擾(RNAi)靜默TRKB基因表現的實驗，驗證了這兩種化合物經由TRKB訊息傳遞的神經保護性。總言之，研究結果顯示ZN014和ZN015可抑制氧化壓力及乙醯膽鹼脂酶活性，並增強BDNF-TRKB訊息，來降低Aβ毒性，有潛能應用在AD的治療上。
利用CRE motifs報導細胞和Aβ-GFP細胞篩選BDNF受體TRKB的小分子促效劑做為阿茲海默症治療策略
(2019) 鄧伃珊; Teng, Yu-Shan
阿茲海默症(Alzheimer's disease, AD)，是一種與年齡相關的神經退化性疾病，會逐漸破壞認知功能、記憶和思考能力。腦源性神經滋養因子(Brain-derived neurotrophic factor, BDNF)，透過活化高親和力受體--旋轉肌凝蛋白相關蛋白質激酶B (Tropomyosin-related kinase B, TRKB)，並隨後磷酸化環磷腺苷效應元件結合蛋白1 (cAMP responsive element binding protein 1, CREB)，來調節神經元存活(Neuronal survival)、新生(Neurogenesis)和神經可塑性(Neuroplasticity)。前人的研究發現BDNF和TRKB在AD患者腦中的表現量降低，且Aβ顯著下調BDNF、TRKB水平與降低CREB磷酸化。TRKB促效劑7,8-二羥基黃酮(7,8-Dihydroxyflavone, 7,8-DHF)，可改善AD小鼠模型的記憶缺陷。此外，黃芩素(Wogonin)透過增加BDNF和CREB表現，可提升海馬迴神經元缺失和認知功能障礙。這些證據顯示大腦中BDNF-TRKB訊息傳遞與AD的關聯性，因此增強TRKB訊息傳遞是有潛力的AD治療策略。先前本實驗室與本校化學系孫英傑老師合作，透過化合物數據庫的化合物相似性搜索進行虛擬篩選，得到DHFS-1 (即Quercetin)、DHFS-2、Kaempferol、Apigenin等4個7,8-DHF類似物。本研究以7,8-DHF為控制組，檢測Wogonin及這4個類似物作為TRKB促效劑的潛能。首先檢測化合物的溶解度(Solubility)，預測化合物的口服生物利用度(Oral bioavailability)、中樞神經系統有效性(CNS-activity)與血腦屏障通透性(Blood brain barrier permeability)，並檢測化合物捕捉自由基和抑制Aβ聚集的能力。之後建立人類CRE motifs驅動GFP表現的293報導細胞，由上述6個化合物中篩選出能顯著提升CREB轉錄活性的7,8-DHF、DHFS-1、DHFS-2、Apigenin。再利用誘導表現Aβ-GFP的人類SH-SY5Y細胞，檢測所篩選出的潛力TRKB促效劑的神經保護作用。7,8-DHF、DHFS-1、DHFS-2、Apigenin四者皆有抑制Aβ蛋白聚集、降低活性氧化物(ROS)以及促進神經突生長(Neurite outgrowth)之能力。四者中DHFS-1、DHFS-2、Apigenin可抑制凋亡蛋白酶-1 (Caspase-1)的活性，7,8-DHF、Apigenin可抑制乙醯膽鹼脂酶(Acetylcholinesterase)活性。此外，TRKB的RNA干擾(RNAi)作用，會抑制7,8-DHF、DHFS-1、DHFS-2、Apigenin促進神經突生長能力。因此除了已知的7,8-DHF外，DHFS-1、DHFS-2、Apigenin也可能是透過TRKB訊息傳遞來促進神經保護作用。本研究將衍生新穎TRKB促效劑，以期提供阿茲海默症治療策略。
利用ΔK280 TauRD折疊報導細胞篩選TRKB促效劑作為阿茲海默症治療策略
(2022) 翁鉦逵; Weng, Zheng-Kui
阿茲海默症(AD)為一種常見的與年齡相關的神經退化性失智症。其病理特徴包含在大腦中存在澱粉樣蛋白-β (Aβ)斑塊和神經纖維纏結(NFTs)的慢性累積。NFTs是由成對螺旋絲(PHF)在神經元內累積而成，而PHF主要是異常過度磷酸化Tau蛋白組成，會誘導一系列毒性事件，最終導致神經元變性和損傷。腦原性神經營養因子(BDNF)為一種神經營養因子。BDNF與其特異性受體原肌球蛋白相關激酶B (TRKB)結合後，導致TRKB二聚化和活化，隨後活化下游訊號，影響cAMP反應元件結合蛋白1 (CREB)在內的蛋白，來促進神經元存活和增加神經可塑性。證據顯示，在AD患者的大腦中BDNF和TRKB的表達量降低，因此增強TRKB訊號被認為是有希望的治療策略。本研究使用表達ΔK280 TauRD-DsRed促Tau錯誤折疊聚集的人類神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞，評估8種化合物抑制Tau錯誤折疊的情形。檢測的化合物中，香豆素衍生物ZN-015和喹啉衍生物VB-030和VB-037可減少細胞內ΔK280 TauRD聚集，並促進神經突生長。通過抑制細菌衍生的ΔK280 TauRD-His在生化分析中的聚集，ZN-015、VB-030和VB-037顯示出化學伴侶活性。此三者雖皆不具DPPH自由基捕捉能力，但ZN-015具氧自由基吸收能力。另外，ZN015、VB-030和VB-037抑制了凋亡蛋白酶-1 (Caspase 1)及/或乙醯膽鹼酯酶(AChE)活性。進一步的TRKB訊息傳遞路徑分析顯示，處理ZN-015、VB-030、VB-037後，細胞內p-TRKB (Y516)、p-TRKB (Y817)、p-AKT (S473)、p-ERK (T202/Y204)、p-RSK (S380)、p-CaMKII (T286)、p-CREB (S133)、BDNF、BCL2蛋白表現顯著增加，並伴隨著凋亡調節蛋白BAX的顯著降低。以TRKB的干擾性核糖核酸(RNAi)靜默TRKB基因表現後，可抑制ZN-015、VB-030、VB-037的促進神經突生長。色氨酸螢光猝滅分析(Tryptophan fluorescence quenching assay)顯示，ZN-015、VB-030、VB-037與畢赤酵母表達的TRKB胞外結構域(TRKB-ECD)直接相互作用，支持其透過TRKB訊號發揮作用。這些化合物作為TRKB促效劑的研究，能為AD提供新的治療策略。
抗發炎相關化合物 VB-037 及甘草次酸在帕金森氏症細胞模式上之治療潛力
(2018) 顏阡聿; Yen, Chien-Yu
帕金森氏症為僅次於阿茲海默氏症之第二常見的神經退化性疾病，主要症狀有手足顫抖、僵硬、動作緩慢、站立不穩等，患者黑質多巴胺神經元大量減少，並出現包含 α-Synuclein (簡稱 α-Syn)蛋白的路易氏體。α-Syn 蛋白本質上無特定結構，易形成不溶性的纖維及聚集。近年研究發現微膠細胞參與的免疫與發炎反應，與帕金森氏症致病機制相關，且細胞外的 α-Syn 蛋白，會刺激微膠細胞產生前發炎激素及活性氧化物。為探究 α-Syn 刺激的發炎反應，本研究以大腸桿菌 BL21 表現 His 標籤的 α-Syn 蛋白，並以親和性色層純化之。2 μg/μl 濃度的單體 α-Syn 於 37°C 培養箱搖晃一週後，Thioflavin T 螢光分析及共軛焦顯微鏡觀察，皆確認了時間依􏰀的 α-Syn 纖維的形成。小鼠 BV-2 微膠細胞以製備的 α-Syn 纖維處理後，前發炎因子一氧化氮(NO) 及 Iba1 上升，喹啉衍生物 VB-037 及五環的三萜系化合物甘草次酸 (glycyrrhetic acid) [中藥脹果甘草(Glycyrrhiza inflata)及芍藥甘草湯 (Shaoyao Gancao Tang)活性成分甘草酸(glycyrrhizin)之代謝產物]，可有效抑制 BV-2 微膠細胞生成的 NO、Iba1 及成熟的介白素-1β (IL-1β)。小鼠發炎抗體矩陣及西方墨點/酵素免疫分析法/即時聚合酶鏈反應驗證，進一步揭示介白素-1α (IL-1α)、介白素-1β、腫瘤壞死因子-α (TNF-α)、干擾素-γ (IFN-γ)、顆粒球巨噬細胞群落刺激因子 (GM-CSF)、介白素-6 (IL-6)及白血球生長激素(G-CSF)，在 α-Syn 纖維刺激發炎的小鼠 BV-2 微膠細胞中表現增加，且 VB-037 及甘草次酸前處理能有效的降低這些前發炎因子的表現與釋放。為檢測抗發炎性的 VB-037 及甘草次酸在帕金森氏症的治療潛能，建立 A53T α-Syn-GFP 誘導表現及 α-Syn 纖維依􏰀聚集形成的人類神經母細胞瘤 SH-SY5Y 細胞，並以佛波酯 TPA 誘導多巴胺神經元指標酪胺酸烴酶 (Tyrosine hydroxylase)表現的神經分化，ProteoStat 染色及西方墨點/ 點漬法試驗顯示，VB-037 及甘草次酸的處理能有效的降低 α-Syn 聚集形成。此研究提供新的應用觀點，來助益於抑制 α-Syn 刺激神經發炎的帕金森氏症治療藥物開發。關鍵􏰁:帕金森氏症、α-Synuclein、神經發炎、VB-037、甘草次酸
探討VPS13C基因和巴金森病的關聯性:針對粒線體的功能研究
(2023) 黃佩璇; Huang, Pei-Syuan
巴金森病(PD)是一種老年人的常見神經退行性疾病。PD的病理特徵包括黑質中含有α-突觸核蛋白組成的路易體積累和多巴胺能神經元(Dopaminergic neuron)的選擇性缺失。根據先前的研究，環境、衰老和遺傳是PD的危險因素。近期遺傳學的研究已經確定了幾個基因是罕見單基因形式PD的原因，這表明錯誤折疊蛋白質的積累、線粒體功能障礙、氧化應激增加、蛋白酶體降解和自噬/線粒體自噬受損以及突觸小泡運輸缺陷，參與了發病機制。VPS13C屬於對囊泡轉運至關重要的大型VPS13蛋白家族。VPS13C有保護粒線體功能的作用。VPS13C耗竭導致線粒體膜電位降低和線粒體超氧化物增加，引發不可逆的線粒體損傷。本研究探討八種中草藥提取物，在線粒體氧化磷酸化解偶聯劑(FCCP)處理的SH-SY5Y細胞中，增強線粒體功能的作用。其中鉤藤、山梔子、蘇木、黃芩和何首烏等五種中草藥提取物，在FCCP處理的SH-SY5Y細胞中，可增加細胞存活率、提升線粒體膜電位，及/或減少線粒體超氧化物。RNA干擾中介的VPS13C基因敲低，亦導致SH-SY5Y細胞存活率降低、線粒體膜電位下降和線粒體超氧化物增加。在TPA誘導多巴胺能分化、VPS13C敲低的SH-SY5Y細胞中，鉤藤、山梔子、黃芩提取物的處理，減少了乳酸脫氫酶的釋放和凋亡蛋白酶-3活性，並促進了神經突生長。此外，這三種中草藥提取物逆轉了VPS13C敲低導致的線粒體膜電位下降和線粒體超氧化物上升。該研究結果將證實VPS13C在PD發病機制中的作用，並為PD治療提供治療策略。
桑葉萃取物及活性成分對抗親聚集Tau中介發炎和粒線體功能障礙的潛力
(2023) 曾沛瑄; Tseng, Pei-Hsuan
阿茲海默氏症(Alzheimer’s disease, AD)是一種與年齡相關的神經退化性疾病，其特徵包括大腦中堆積的Amyoild β斑塊及Tau蛋白聚集的神經纖維纏結(Neurofibrillary tangles, NTF)，影響突觸和認知功能。神經纖維纏結主要由過度磷酸化的Tau蛋白組成，該蛋白會自我聚集並失去微管穩定功能。Tau聚集體可活化小膠質細胞使其釋放發炎因子，並進一步促進神經元中Tau蛋白過度磷酸化。此外，過度磷酸化的Tau蛋白會破壞線粒體功能，從而導致突觸功能障礙。因此，減少小膠質細胞介導的神經炎症，可能有利於改善病理性Tau介導的線粒體功能障礙。由於桑葉(Morus alba L.)已被報導具有抗氧化和抗炎活性，因此本研究聚焦在桑葉萃取物及其七種報導的抗氧化成分。通過HPLC分析桑葉萃取物的化學特徵，色譜圖顯示對應於槲皮素-3-O-芸香苷(QR)、槲皮素-3-O-葡萄糖苷(QG)、山奈酚-3-O-葡萄糖苷(KG)、綠原酸(CGA)和隱綠原酸(4-CQA)的峰值。MTT細胞活力測定顯示桑葉萃取物及其活性成分對BV-2和SH-SY5Y細胞的細胞毒性非常低(IC50大於10 mg/ml或100 μM)。所有七種測試化合物在生化測定中均表現出自由基清除活性和/或氧自由基吸收能力。本研究利用大腸桿菌製備His標記的ΔK280 Tau重複結構域(TauRD)原纖維(Fibril)，並且在冷凍電子顯微鏡(Cryo-TEM)下觀察到寡聚的Tau聚集體。生化硫黃素T螢光測定顯示，QR、QG、槲皮素-3-O-(6-乙酰基)-葡萄糖苷(QAG)、CGA和4-CQA可顯著減少ΔK280 Tau蛋白的聚集。製備的ΔK280 Tau原纖維誘導BV-2微膠細胞活化，這一點可通過細胞型態的改變、一氧化氮(NO)產生的增加和細胞中IBA1和MHCII的表達增加來揭示。桑葉萃取物可以抑制NO、IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎介質的產生，並降低BV-2細胞中NLRP3發炎小體及凋亡蛋白酶-1的活化。收集激活的BV-2細胞的條件培養液(Condition media)，並應用於ΔK280 TauRD-DsRed SH-SY5Y細胞引發細胞炎症，桑葉萃取物能降低細胞釋放乳酸脫氫酶、減少細胞活性氧的產生來減輕粒線體損傷、並增加神經突的生長，達到神經保護作用。該研究結果可能支持桑葉萃取物作為改善AD疾病症狀的新療法的概念。
研究新穎化合物上調第三型小腦萎縮症SH-SY5Y细胞自噬降解突變ATXN3蛋白的治療作用
(2023) 許少凡; Hsu, Shao-Fan
聚麩醯胺(polyQ)介導的脊髓性小腦共濟失調(SCA)是由編碼polyQ束的CAG三核苷酸重複序列異常擴增引起的異質性退化性疾病。錯誤折疊和聚集的polyQ蛋白是polyQ疾病的一個共同特徵，會導致神經元功能障礙和退化。在SCA中，第三型脊髓性小腦共濟失調症(SCA3)是全球最常見的形式。SCA3的特點是染色體14q32.1上ATXN3基因的CAG重複擴增，在正常個體中重複次數為10至44次，在大多數臨床診斷患者中則重複61至87次。由於擴增的polyQ蛋白的積累可能是致病性的初始事件，因此通過自噬清除聚集蛋白，被認為可以抑制廣泛的下游有害作用，以促進神經細胞存活。因此，本研究旨在尋找可以通過激活自噬作用來清除聚集的ATXN3/Q75的潛在化合物。共測試了10種化合物，包括5種吲哚衍生物和5種香豆素衍生物。其中，吲哚衍生物NC009-1、-2、-6和香豆素衍生物LM-031在Thioflavin T結合和點印跡分析中，會抑制大腸桿菌衍生的ATXN3/Q75蛋白聚集。使用誘導DsRed-LC3表達的HEK-293螢光報告細胞，發現NC009-2、-3和LM-031的處理顯著誘導了DsRed-LC3向自噬體的募集。在ATXN3/Q75-GFP SH-SY5Y細胞中，與未處理的細胞相比，NC009-1、-2、-6和LM-031顯示出良好的聚集抑制潛力，及改善神經突生長，而NC009-1、3、6和LM-031降低ATXN3/Q75蛋白表達後上升的活性氧化物。NC009-1、-2、-6和LM-031通過增加細胞中磷脂醯乙醇胺(PE)偶聯的LC3-II/細胞質LC3-I的比率來啟動自噬。該研究結果可能提供polyQ介導的疾病治療策略的參考。關鍵詞：第三型脊髓性小腦共濟失調症、聚麩醯胺、ATXN3、自噬作用
降低Aβ聚集導致阿茲海默氏症之新穎甘草查爾酮A與香豆素之衍生物的藥物開發
(2017) 李欣穎; Lee, Shin-Ying
阿茲海默氏症(Alzheimer's disease，簡稱AD)，是老年癡呆症中最普遍的類型，臨床症狀包括漸進性認知功能下降以及長期記憶損傷。阿茲海默氏症的病理特徵主要可分為細胞外β-澱粉樣蛋白(β-Amyloid，簡稱Aβ)聚集形成的澱粉樣蛋白斑塊(Amyloid plaque)，以及細胞內過度磷酸化tau蛋白形成的神經纖維纏結(Neurofibrillary tangles，簡稱NFTs)。Aβ斑塊造成神經細胞死亡的途徑包括氧化壓力提升、細胞外毒性、能量耗損以及細胞凋亡等，因此新Aβ聚集抑制劑的開發對於阿茲海默氏症的治療十分重要。甘草查爾酮A (Licochalcone A)及香豆素(Coumarin)為來自植物的天然化合物，具增強粒線體新生及/或抗氧化的功能。為了改善甘草查爾酮A及香豆素對阿茲海默氏症的可能治療效果，先前的研究透過化學修飾合成五種可抑制第三型小腦萎縮症polyQ蛋白聚集及幫助tau蛋白摺疊的衍生物。本研究首先以生化實驗檢測甘草查爾酮A、香豆素及五種合成衍生物捕捉自由基及抑制Aβ 聚集之能力。接著利用誘導表現Aβ-GFP之293/SH-SY5Y細胞，檢測待測化合物降低Aβ錯誤折疊及神經保護作用。在檢測的化合物中，衍生物LM-031細胞毒性最低，且具有自由基捕捉能力及Aβ聚集抑制能力，並可降低Aβ-GFP 293細胞中Aβ的錯誤折疊及相關的活性氧化物、凋亡蛋白酶-3活性，及促進Aβ-GFP SH-SY5Y細胞神經突生長。LM-031、甘草查爾酮A及香豆素可增強熱休克蛋白HSPB1表現，來增加Aβ-GFP融合蛋白溶解度，並正調控轉錄因子NRF2，來促進抗氧化反應元件依存的NQO1及GCLC表現。此外，在Aβ-GFP SH-SY5Y細胞中，LM-031、甘草查爾酮A及香豆素皆可增加與細胞存活、生長及/或抗凋亡相關因子的表現，如腦源性神經滋養因子BDNF、cAMP效應元件結合蛋白CREB、B细胞淋巴瘤蛋白-2 BCL2、胞外訊息調節激酶(ERK) 1/2、AKT絲胺酸/蘇胺酸激酶1 (AKT)等。本研究結果顯示甘草查爾酮A、香豆素及新穎查爾酮-香豆素雜合物LM-031可降低Aβ聚集及神經保護，提供臨床上阿茲海默氏症治療新的參考策略。關鍵字：阿茲海默氏症，β-澱粉樣蛋白，查爾酮-香豆素雜合物，抗氧化，抗凋亡。