Browsing by Author "Cheng-Kang Pai"

Filter results by typing the first few letters
Now showing 1 - 1 of 1
  • No Thumbnail Available
    Item
    雙功能半纖維素分解酵素之基因選殖及其在木質纖維素分解之應用
    (2010) 白正康; Cheng-Kang Pai
    在品質較差而價格較低廉的草料中，往往含有較多難以被酵素分解的聚木糖與木質素等成分，這些成分的存在，間接影響了牛隻的飼料使用效率；然而，台灣水牛(Bubalus bubalus carabanesis)為一沼澤生活型的牛種，具有極高抵抗環境壓力與適應粗草料的特性。本論文從台灣水牛的瘤胃真菌Neocallmastix patriciarum S20中，選殖出一個具有雙功能的聚木糖分解酵素基因，名為xynS20E，並利用此酵素進行了以下的研究： 第一部分 – 從瘤胃真菌Neocallmastix patriciarum S20 cDNA庫中選殖具有雙功能聚木糖分解酵素的基因 本研究從N. patriciarum cDNA庫中選殖出一條具有乙醯化聚木糖酯酶活性與聚木糖酶活性的酵素基因，命名為 xynS20E。此基因具有一個2,016鹼基對的完整序列，其中包含162鹼基對的5’端非轉譯區與243鹼基對的3’端非轉譯區。此基因可轉譯出671個胺基酸的蛋白質，分子量約為72.4 kDa。其胺基酸序列中， N端具有一個碳水化合物酯酶第1族(carbohydrate esterase family 1)的功能性區域，而C端具有醣苷水解酶第11族(glycosyl hydrolase family 11)的功能性區域。此外，在這兩個功能性區域之間，則含有兩個真菌搭載結合蛋白第1型(fungal dockerin domain type I)之序列。後續實驗中，利用基因工程技術，將xynS20E選殖於pET29a表現載體，並利用大腸桿菌大量表達此帶有6個組胺酸之重組酵素，並藉由鎳離子親和性管柱純化，以製備XynS20E酵素。 第二部分 – 利用反應曲面法最佳化XynS20E之乙醯化聚木糖酯酶與雙功能聚木糖酶 反應曲面法搭配複合式中心設計法與統計迴歸分析可以有效率地得知酵素最佳反應活性的溫度與酸鹼值。利用此方法，得知XynS20E的乙醯化聚木糖酯酶在58°C與pH 8.2具有最佳比活性，為873.1±18.0 U/mg；XynS20E的聚木糖酶在49°C與pH 5.8達到最佳比活性，為128.7±32.9 U/mg。另外，乙醯化聚木糖酯酶功能性區域被獨立選殖於表現載體pET29a中，命名為AxeS20E。AxeS20E經由反應曲面法分析，於54.6°C與pH 7.8時具有最佳比活性；在80°C加熱120分鐘後，仍可保有85%以上的酵素活性，展現良好的耐熱穩定性。 第三部分 – 利用嵌合體酵素分解木質纖維素 XynCDBFV唯一已知具有高活性之聚木糖酶。應用反應曲面法更進一步地得知此酵素的最佳反應條件為55.3°C與pH 5.3，此反應條件下可測得比活性為9543.6±434.9 U/mg；進一步利用基因工程技術，分別將AxeS20E融合於XynCDBFV的N端與C端，並在兩個酵素之間設計了二個重複的GGGGS胺基酸鏈作為連結，產生兩個不同的嵌合體酵素(分別命名為AxeS20E-XynCDBFV和XynCDBFV-AxeS20E)。以反應曲面法分析此二嵌合體酵素，可得AxeS20E-XynCDBFV的最佳反應條件為62°C與pH 5.4，最佳比活性為6225.4±528.5 U/mg； XynCDBFV-AxeS20E的最佳反應條件為60°C與pH 5.4，最佳比活性為3945.6±154.1 U/mg。AxeS20E-XynCDBFV和XynCDBFV-AxeS20E在耐熱穩定性實驗中，在60°C環境中處理120分鐘後，分別保有60%與80%以上的原始活性；此雙功能融合酵素在協同效益的測試中，聚木糖分解能力較單一酵素單獨作用降低了8% ~ 30%酵素活性；將天然稻桿以酵素處理48小時後，以AxeS20E-XynCDBFV和XynCDBFV-AxeS20E處理分別較單一酵素處理時提高了1.3和1.2倍的還原糖濃度。 本研究為第一個從瘤胃真菌中發現具有乙醯化聚木糖酯酶與聚木糖酶的雙功能聚木糖分解酵素。結果亦顯示，反應曲面法搭配複合式中心設計法與統計迴歸分析提供了一個尋求反應條件最佳化的有利策略。研究並證實，AxeS20E具有良好的耐熱穩定性，此一特點將是應用於工業發酵中相當受到重視的一環；此外，人造雙功能嵌合體酵素展現了高於單一酵素的木質纖維素分解效率。