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    Qualitative and Quantitative Profiling of Protein Phosphorylation Using Immobilized MetalAffinity Chromatography and LC/MS
    (2007) 蔡家烽; CHIA-FENG TSAI
    蛋白質磷酸化在細胞訊息傳遞及功能調控上扮演關鍵角色。蛋白質的磷酸化是一個動態現象，在細胞內的含量低，並且不同位置的磷酸化可能有不同的功能。對於蛋白質磷酸化進行定性與定量的分析有助於我們了解這些訊息傳遞的複雜過程，所以發展高效能蛋白質磷酸化的分析方法仍是一個重要的課題。 在本論文中，我們結合凝膠電泳（SDS-PAGE）,金屬親和層析( Immobilized Metal Affinity Chromatography, IMAC),免標記定量法( Label Free)和質譜 (Mass Spectrometry, MS)技術分析磷酸化蛋白體。在定性的實驗方面，我們針對影響金屬親和層析法專一性的因素作最佳化研究。本實驗中，我們發現待測樣品的pH、系統溶液的種類和濃度以及溶液中所含的鹽類的種類都會影響其專一性和回收率。在定量實驗方面，我們以免標記定量法為平臺，利用所加入標準品的層析譜峰面積去校正分析物的層析譜峰，可進行相對定量。我們將此方法分別應用於標準蛋白質和複雜的細胞樣品，為了證明此分析平台的可用性，我們將其應用在分析H1299細胞中的磷酸蛋白上，並以凝膠電泳為輔作細胞蛋白的一維分離，我們可鑑定出1598個磷酸化蛋白質共含有12353個磷酸化胜肽，在所有鑑定出的胜肽中，磷酸化胜肽純化專一性達百分之80。並且其定量的標準誤差可以小到0.3左右。證明此平台能廣泛應用在分析大量蛋白質磷酸化的研究上。