Browsing by Author "李冠群"

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人類海藻糖水解酶重組蛋白之表達
(2014) 游舒琇; Shu-Hsiu Yu
海藻糖 (trehalose) 是一種非還原性的雙糖，由兩個葡萄糖分子以 α,α-1,1- 糖苷鏈結形成，存在於多種生物體中，除了可以做為生物能量來源，亦有穩定蛋白質與細胞膜等重要生理功能。海藻糖水解酶 α,α-Trehalase (TreH) (EC 3.2.1.28)，可將海藻糖水解成兩個葡萄糖，廣泛的存在於微生物與動植物中。人體不同組織中亦含有 TreH，例如小腸與腎臟絨毛膜的 TreH 負責海藻糖的水解以利吸收，另外，血漿中亦含有TreH，有研究顯示血漿中具有高 TreH 活性的人較容易罹患糖尿病。然而，目前為止對於人類 TreH 的生化特性、功能與結構的研究非常稀少。本研究將選殖的兩種人類海藻糖水解酶 isoform1 (hTreH1) 和 isoform2 (hTreH2) 的基因，利用三種蛋白表達系統，包括原核生物的大腸桿菌 (Escherichia coli) 表達系統、真核生物的畢赤酵母菌 (Pichia pastoris) 表達系統和昆蟲桿狀病毒表達系統 (baculovirus expressing vector system)，以便生產具功能性的重組酵素。其中，兩種 hTreHs 在大腸桿菌表達都形成不可溶的內涵體，以隨機突變技術篩選 80 個突變株，並未獲得可表達水溶性酵素之突變株；在畢赤酵母菌表達出的胞外重組酵素量極微，在培養液中無法偵測到 TreH 活性；而在昆蟲桿狀病毒表達系統中有表達出重組酵素，但是仍然形成不可溶的蛋白沉澱。部分可溶的重組蛋白可以非變性的蛋白萃取條件萃出，然而這些萃出的重組蛋白還是不具活性。本研究所採用的方法中沒有表達出具有活性的重組蛋白，為了得到可溶且具有活性的重組蛋白，需要再進一步做更深入的研究。
利用脂肪酶催化合成或自中草藥分離新穎性唾液酸衍生物及其對脂多醣的結合力分析
(2017) 鄭玳育; Cheng, Tai-Yu
唾液酸(Sialic acid, SA)又稱為N-乙醯神經胺酸（N-acetylneuraminic acid, Neu5Ac）屬於具有高度可變化學結構的醣類家族。在真核生物中，含SA的結構分子參與許多重要的生理和病理過程，如細胞間的黏附、病毒或細菌與目標細胞的結合等。因此，SA及其衍生物在保健食品和製藥工業中具有廣泛的應用。而革蘭氏陰性菌是常見的敗血症病原體，位在細菌外壁上的脂多醣 (Lipopolysaccharide, LPS)，其結構包含了具有親水性的多醣組成，以及疏水性的脂質組成，即脂質A (lipid A)，脂質A毒性會引起強烈的免疫反應。 SA已被證明能夠中和LPS毒性，但SA為親水性不具疏水性結構，為了提高SA對LPS的親和力，本研究中利用脂肪酶進行SA酯化或轉酯化反應，以產生新的唾液酸酯類衍生物，提升唾液酸的疏水性。使用SA及油酸做為反應物進行兩相酯化反應，加入重組脂肪酶Candida rugosa lipase 1~4 (CRL1~4)進行催化反應，結果並未發現產物形成，SA也沒有減少。使用不同鏈長脂肪酸酯和SA於有機溶劑中進行單相轉酯化反應，使用冷凍乾燥的重組CRL1~4、市售CRL或Novozymes Eversa Transform (即Thermomyces lanuginosus lipase, TLL)催化反應亦未有產物產生。當SA與vinyl acetate進行兩相轉酯化反應時，使用固定化Novozymes 435可達到90.5 %的最高轉化率，其次為重組脂肪酶CRL1、CRL4、及Novozymes TLL依序為53.7 ％、34.5 ％和28.2 %。當SA與vinyl propionate反應時，使用固定化Novozymes 435可達到92.5 %的最高轉化率，其次為CRL1及CRL4，轉化率依序為75.3 %及63.0 %。當SA與vinyl laurate反應時，固定化Novozymes 435、CRL1和CRL4的轉化率分別為67.2 ％、49.6 %、35.8 ％。使用vinyl palmitate作為基質，Novozymes435、CRL1及CRL4催化之轉化率分別為51.9 ％、68.4 %及17.0 %。由此可知，不同酵素對相同受質有不同的催化活性，而且同一種酵素對不同鏈長度脂肪酸酯受質，也有不同的催化活性，同時，相較於混合了多個isoforms的CRL商業化酵素，個別重組CRL isoforms的催化效率較佳。以前的研究表明中草藥LS含有唾液酸衍生物，透過加熱萃取和鹽酸水解，並使用HPLC進行分析和收集，得到一種可能為唾液酸衍生物LS-2。使用表面電漿共振技術 (Surface Plasmon Resonance, SPR)，我們比較了唾液酸和新型唾液酸衍生物LS-2對LPS的親和性。由於利用商業化SPR晶片所製作的SA固定化晶片，對LPS的靈敏度極低，故自行製作出一種對LPS有高靈敏度的Cys-SA 晶片，測得SA 與LPS的結合常數為KA =6.82 x 1010 M-1，顯示此晶片適合用來偵測LPS，而使用自行製作的Cys-LS-2 晶片測得LS-2對LPS的親和性比唾液酸高，結合常數為KA=1.10 x 1013 M-1，本研究結果可以應用於工業化生產唾液酸衍生物，擴展唾液酸衍生物的應用潛力。