Browsing by Author "莊青青"

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    利用多變量分析於中藥分辨
    (2007) 莊青青; Chuang Ching-Ching
    中文摘要 高效液相層析儀(HPLC)及感應耦合電漿質譜儀（ICP-MS）為測定中藥指標成分及微量元素的常用分析工具。本研究開發分析方法，進行藥材的成分分析及樣品辨識。 本研究共分三部份，第一部份為利用加味逍遙散HPLC的有機成分(30 peaks)定量結果及ICP-MS的無機元素(44個元素)測定數據，以人工歸納及統計分析方法建立識別廠牌的準則。觀察各樣品有機成分中成分2 ( Gallic acid ，GA ) 及成分26 ( Paeonol ，PN)的差異，發現利用成分2/IS比值可明顯將所有樣品分成兩組，順天堂、勝昌、科達其值高於1.45，而港香蘭、莊松榮低於1.45；繼而以2/26的比值(順天堂>2.1、1.8<勝昌<2.1、科達<1.8、港香蘭<2.3、莊松榮>2.5)再行細分，則各家廠牌產品就可順利分辨。依上述準則，在五家廠牌共33批樣品中，只有4批樣品分類錯誤：勝昌2批、港香蘭1批其2/IS比值分別為2.21、2.37和1.67，且2/26的比值高於2.1被判定為順天堂；順天堂1批其2/IS比值為1.65，且2/26的比值在1.8與2.1之間被判定為勝昌，整體而言，人工辨識正確率約88 ％。將30 peaks的分析數據進行多變量分析(Multivariate Analysis)處理：主成分分析(Principal Component Analysis ，PCA)發現，PC1(1、11和14)、PC2(2、6、24和25)和PC3(23、27和28)代表61.343% 的總變異性；以PC1、PC2和PC3作成的三度空間PCA圖顯示，各廠牌樣品各自群聚在特定位置，順天堂在中間偏上方，勝昌在左下方，科達在中間，港香蘭在右下方，莊松榮在中間偏下方，分類良好。進行群聚分析(Cluster Analysis (CA)亦能明確分類，在群聚距離設定為0.38（最大刻度為1）後，依次出現順天堂、莊松榮、港香蘭、勝昌、科達等五聚落。進行線性區別分析(Linear Discriminant Analysis ，LDA)， 其原始分類(original)雖達100％，但在交叉驗證(cross-validated)卻只有13.8 %的正確性，因此先用逐步區別分析(stepwise-LDA)選出1(nicotinic acid)、 8(Geniposide)、13 、17 、19、20 、23 、24等8 peaks，再用LDA統計則可得到完全正確的分類結果，該方法亦可正確判斷任一市售樣品的廠牌，另外，17和19在判定函數1中的變數有最大的比重(-26.620 和 –18.404)，判定函數2主要由20和24 (-11.716和-12.520)所組成，判定函數3主要由17、23和24 (21.550、20.372和-17.723)所組成，判定函數4主要由17、24和20 (-8.869、-6.954和6.051)所組成。 用ICP-MS測量各樣品，可得到44個無機元素的分析數據，仔細比對這些數據的差異性，僅能分辨順天堂、勝昌及港香蘭三家產品，而科達及莊松榮的所有元素含量都非常接近，且誤差線範圍內有很大的重疊，人工難以辨別。將該44無機元素的分析數據進行多變量分析：主成分分析顯示，PC1(La、Ce、Nd和Pr)、PC2(Al、Mg和Br)和PC3(I和As)代表71.944% 的總變異性，以PC1、PC2和PC3繪製的的三度空間PCA圖指出，順天堂在左下方，勝昌在左上方，科達在右下方，港香蘭在右上方，莊松榮在中間偏下方，各自形成聚落、分隔明顯。群聚分析以距離0.41（最大刻度為1）處理後，明確分成五個聚落，依次為順天堂、莊松榮、港香蘭、科達、勝昌。線性區別分析，其原始分類可達100％，但交叉驗證只有17.2 %的正確性，因此先以逐步區別分析自44個元素中選出Na、Mg、Al、Ni、Cu、I、Ce、Bi、U等9個元素，再用LDA統計則可得到完全正確的分類結果，所有的加味逍遙散樣品皆能無誤地分類，該統計分析方法亦可正確判斷任一市售樣品的廠牌，其中 Mg、Na和Cu(-2.443、2.203和2.140)在判定函數1中的變數有最大的比重，判定函數2主要由Ce和U (-6.208和4.730)所組成，判定函數3主要由Cu、Mg和I (1.843、-1.126和1.063)所組成，判定函數4主要由U、Mg和Ce (1.185、1.115和-1.021)所組成。 另外，隨機抽取三個樣品，以比較五家廠牌的同質性，發現順天堂、莊松榮及勝昌生產之不同批次樣品，相似度最高，分別為0.23、0.22及0.21，品質最穩定，港香蘭及科達所生產之商品相似度較差，分別為0.16及0.09，品質較不穩定。 第二部份為枳實(Aurantii Fructus Immaturus)及枳殼(Aurantii Fructus Maturus)之分析與辨識。從台灣及中國的中藥市場收集20批枳實[綠衣枳實(Poncitrus trifoliata)]和30批[酸橙枳殼 (Citrus aurantium)，香圓枳殼(C. wilsonii)]樣品，經外觀判別及組織鏡檢，再以HPLC分析這些樣品中的12個主要的成分；該HPLC分析方法以Cosmosil 5C18-AR為分析管柱，以KH2PO4水溶液及MeOH/CH3CN之混合液為沖提液，可在60分鐘內順利完成分離，積分面積的RSD為0.30-1.21(intraday) 及0.45-1.93 (interday) ，偵測極限在2.84-6.85 ng之間。分析結果顯示，枳實與枳殼可用NR、 HE、 NE和QU等成份之有無來判別，枳實樣品中沒有或幾乎沒有HE及NE等成份，而枳殼樣品中沒有或很少NR及QU成份；兩枳殼(酸橙及香圓)的差異，則可用NGC及HE的成分的含量及HE/NG，HE/NE與NGC/NE比值分辨， 該等比值在酸橙枳殼分別為0.49以上、2.30以上及0.21以上，在香圓枳殼則在0.40以下、1.31以下及0.21以下，但有5批不易判別，依相近數據，判定分屬兩品種。將12 peaks的分析數據代入多變量分析軟體，發現不論PCA、CA或LDA均能明確分辨綠衣枳實、酸橙枳殼或香圓枳殼，經交叉驗證或添加試驗，均得到完全正確的結果。值的注意的是，5批用人工不易判別的樣品皆清楚落入香圓枳殼的群聚，與人工辨識有著很大的不同。 第三部份，我們利用本實驗室已有的HPLC分析方法，測定牡丹皮(Moutan Cortex) 、厚朴(Magnoliae Cortex)、防己(Fangchi Radix)等的主要有機成分及微量元素含量。我們曾比較水煮及消化兩種前處理方式，發現後者約為前者的102到104倍，但所有數值皆呈平行關係，因此選擇與中藥煎煮情形相同的水煮方法，製作檢液。 1.牡丹皮(Moutan Cortex): 收集23批市售牡丹皮樣品，分屬西昌丹皮（Paeonia delavayi，10批）、川丹皮（P. suffruticosa，13批），用HPLC測量4,6-di-GG (1，G為glucose)，1,2,3,6-tetra-GG (2) ，1,2,3,4,6-penta-GG (3) ， 1,3,4,6-tetra-GG (4) ，3,4,6-tri-GG (5) ，1,3,6-tri-GG (6) ， 3,6-di-GG (7) ，1,2,6-tri-GG (8) 。paeoniflorin（Pf）和paeonol(PN)等10成分含量。發現由PN/Pf及3/2的比值就可區別西昌丹皮(PN/Pf > 1， 3/2>15.1)與川丹皮(PN/Pf< 1， 3/2<11.4) ；整體而言，人工辨識正確率為100％。將10 peaks分析數據輸入PCA、CA及LDA軟體 ，發現主成分分析與線性區別分析，都能正確分辨各批藥材所屬的品種，後者的交叉驗證亦證實100 %正確。但群聚分析則無法分辨，因此以逐步區別分析選出peak1(4,6-di-GG)、peak4(1,3,4,6-tetra-GG)、Pf(paeoniflorin))等3成分，再進行群聚分析，但也無法正確分類；不過只用該三peaks的定量數據，進行線性區別分析，卻也可得到100%的正確結果，顯示用LDA統計分析時，不論10成分或3成分都能明確分辨基原，但後者更為簡捷。 仔細觀察18批牡丹皮樣品(西昌丹皮9批、川丹皮9批)的62種元素之分析數據，發現Ge、Mo、Cd、Ce及Tl等五元素，在兩品種中相異性最顯著，用該五元素的分析數據作為人工辨識的工具，正確率達100％。若將62種元素分析數據用主成分分析、群聚分析及線性區別分析軟體處理，則只有PCA可達到完全正確的分類目標，CA無法分辨，LDA之原始分類雖有100%正確性，但交叉驗證卻只有50%的分辨率。我們用stepwise-LDA選出Be、V、Ag、Cd、Tl、Pb、Bi及Th等8元素，用該8元素為變數，則CA及LDA兩統計分析模式，均能完全確認所有樣品的基原。 2.厚朴(Magnoliae Cortex)： 收集22批分屬川厚朴（Magnolia officinalis Rehd. Et Wils，12批）、凹葉厚朴 [M. officinalia ssp. biloba （Rehd. et Wils.）Law，4批]、和厚朴(M. obovata THUNB. ，6批)的市售藥材，用HPLC測量(-)-magnocurarine (1)， (+)-magnoflorine (2)，(+)-laurifoline (3)，(+)-oblongine (4)，(+)-menisperine (5)，(+)-xanthoplanine(6)，(+)-N-methylglaucine (7)等七個生物鹼及Honokiol (8)， Magolol(9)兩個酚類成分含量。發現由2/1及9/8的比值可挑出屬於川厚朴(2/1>5.102及9/8<1.397)的樣品，再由2/3及4/3的比值就可區別凹葉厚朴(2/3<6.458及4/3<1.130)與和厚朴(2/3>18.901及4/3>3.156)，用這流程的人工辨識正確率為100％。將9 peaks的定量結果輸入PCA、CA及LDA軟體，發現各統計方法都能迅速歸納出基原與成分的關係，分辨結果完全正確；以 stepwise-LDA處理，選出7及8兩成分作為新變數，結果顯出只用該二吸收峰的定量數據，亦能精確指示任一樣品所屬的基原。 用收集9批厚朴樣品(川厚朴7批、凹葉厚朴2批)的46個無機元素之分析數據，經仔細比對其差異性，發現Fe、Pb、V、Zr、Sb、Bi、Th等七元素可作為人工分辨依據。我們將46個元素的分析數據，以PCA、 CA及LDA處理，結果顯示PCA及LDA均能正確分類，CA則無法明顯劃分群落；用stepwise-LDA自46個元素中選出Sc、Cu、Sr、Zr和Th等5個元素，以該5數據為變數，不論CA或LDA均能正確分辨，前者至距離0.31(最大刻度為1)就可將川厚朴與凹葉厚朴分成兩群落，後者用五元素與四十六元素均能得到100%的交叉驗証。 3.防己（Fangchi Radix）： 收集37批分屬日防己(Sinomenium acutum 5批)、粉防己（S. tetrandra 11批）、廣防己（Aristolochia fangchi 15批）、木防己(Cocculus trilobus 6批)的防己樣品，用HPLC分析各藥品發現日防己含有 acutumidine (1)、 magnoflorine (2) 、 stepharine (3) 、 sinomenine (4) 、 acutumine (5) and tetrandrine (9)， 粉防己含有 sinomenine (4) 、 cyclanoline (6) 、 fangchinoline (7) 、 berbamine (8) 、 tetrandrine (9) and isotetrandrine (10)， 廣防己含有magnoflorine (2) 、 tetrandrine (9) 、 aristolochic acid II (12) 、 aristolochic acid I (13) 、 aristololactam (14) 和未知成份 X(推測應該是aristoloactone)， 木防己含有magnoflorine (2) 、 sinomenine (4) 、 tetrandrine (9) 、 trilobine (11) 、 isotrilobine (15),和未知成份 A and B ，各不同品種藥材可由指紋圖譜分辨。以18 peaks分析數據進行多變量分析，發現不論主成分分析、群聚分析或線性區別分析，均能將各樣品依所屬基原迅速分類，正確性及相似度都相當明確，也可用於判定未知樣品的基原。以逐步區別分析自18 peaks中選出2、4、7、11、15等5成分，再用LDA統計亦可得到完全正確的分類結果。 用ICP-MS測量16批防己樣品(日防己2批、粉防己4批、廣防己10批)的55微量元素含量，發現其中Be、Mn、Br、Yb、Tl、U、Bi的差異性，可作為人工分辨依據。將全部55元素數據輸入多變量分析軟體，發現只有主成分分析能達到分辨基原的目標，線性區別分析原始分類雖為100%正確，但交叉驗證只有12.5%的分類結果。我們繼而用逐步區別分析(stepwise-LDA)挑選出Be、Mn、Br、Yb、Tl、U、Bi等7元素作為變數，再進行群聚分析及線性區別分析，結果顯示兩種方法都可以得到完全正確的分類效果。