Browsing by Author "翁依蘋"

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    利用奈米金標記與冷凍電子顯微鏡定位蛋白質複合體的次單元：RNA聚合酶II/TFIIF複合體的研究
    (2007) 翁依蘋
    冷凍電子顯微鏡已經成為結構生物學中一個成熟的工具，特別是可以用來解析無法結晶的巨分子蛋白複合物的近原子結構。在真核生物的蛋白複合物結構生物學中，要去定位每一個獨立的蛋白質次單元是一件非常重要的問題。 傳統上，免疫金（約 5~10 nm）的標記技術被利用在標記獨立的次單元，而負染色電顯足以有效造影。然而免疫金技術需針對蛋白質複合體上的每一個次單元體培養單株抗體，已特異標定次單元體的位置，這種作法是相當昂貴且耗費時間的。此外，由於我們需要較高解析度的影像，免疫金的大小過大（約 5~10 nm），不適合較高解析度的次單元體定位，因此我們在此使用較小的奈米金（1.8 nm）進行標定。 人類基本核酸代謝的酵素複合物大部分在酵母菌中可以找到對應之同源蛋白質複合物，我們利用對酵母菌做基因的操控便利，將小段的胜肽插入所要尋找的次單元中，並利用可辨識該胜肽的小蛋白標記奈米金去定位此段胜肽。 在本篇論文中，我們針對RNA聚合酶轉錄因子TFIIF做研究，它是具有三個次單元的轉錄起始因子，我們能夠純化具有這三個次單元的RNA聚合酶（Tfg1、Tfg2、Tfg3），並在每個次單元中插入攜鈣素親和胜肽（Calmodulin binding peptide），再以純化之攜鈣素（Calmodulin）標記奈米金，使標記奈米金的攜鈣素能與攜鈣素親和胜肽結合，達到定位次單元的目的。 一開始，我們成功的達到這樣的結果，並且利用醋酸鈾負染色取得高對比電顯影像，但是後來我們無法從電顯影像分辨真實的奈米金與醋酸鈾奈米顆粒的差別，導致影像處理上變得非常困難。因此，我們必須利用冷凍電子顯微鏡去觀察，才不會有負染色背景的訊號。於是需找到適合的條件，做出乾淨的無序冰，並且取得RNA聚合酶和1.8 nm的奈米金分別的影像。目前我們正利用此項冷凍電子顯微鏡的技術去取得被1.8 nm的奈米金標記RNAP/TFIIF的影像，以達到定位Tfg1、Tfg2、Tfg3的目的。