Browsing by Author "李冠群 博士"

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    脊髓小腦運動失調症第十七型：微生物模型之藥物篩選
    (2009) 史哲維; Che-Wei Shih
    摘要 目前已知道有十種遺傳性神經退化疾病為多麩醯胺 (polygluta- mine, poly-Q)相關的疾病，其中第十七型脊髓小腦萎縮症 (SCA 17)，起因於染色體6q27位置上的TBP基因之轉譯區中，發生CAG三核苷酸重複擴增所導致。因此SCA17的可能分子致病機制為：突變的TBP蛋白質上具有延長的poly-Q片段，導致蛋白質結構錯誤摺疊及聚集，最後形成不溶性的包涵體，因而造成細胞死亡。已知在活體 (in vivo)和試管內 (in vitro)實驗中也可以發現，抑制錯誤延長性poly-Q片段的蛋白聚集，可以抑制poly-Q相關疾病的產生。本研究建立TBP-Lac Zα 融合蛋白於大腸桿菌中的表達系統，藉由β半乳糖苷酶之α互補作用，建構出微生物快速藥物篩選系統，以期加速相關藥物的開發。質體建構方面，是以pGEX 質體為基礎建構數種蛋白表達質體，包括帶有不同延長poly-Q的pGEX-TBP-lac Zα以及pGEX-Lac Zα重組質體。蛋白表達方面，將相關質體轉型至數種大腸桿菌 (E. coli)，以藍白篩選的方式，找出合適的菌種與表達條件，用以表達可溶性的短延長TBP蛋白 (培養液呈藍色)、及不可溶性長延長TBP蛋白 (培養液呈白色)。利用表現型分析、基因型分析、蛋白質電泳、西方轉漬分析以及β半乳糖苷酶活性分析，確立藥物篩選系統的可行性並驗證之。結果發現JM109大腸桿菌表達系統符合篩藥條件 (即pGEX-Lac Zα呈藍色、pGEX-fTBP40Q-Lac Zα呈白色)，故pGEX-fTBP40Q-Lac Zα/JM109可以作為篩藥模式。藥物篩選方面，目前以具有潛力之藥物 (例如海藻糖與剛果紅)做測試，結果發現這兩種藥物似乎無法抑制不可溶性長延長TBP蛋白凝集。本篇論文提供一種可以大量快速進行SCA17藥物篩檢的微生物模式，新穎的合成藥物仍在持續篩檢中，以找出有效抑制不可溶性長延長TBP蛋白凝集之藥物以供細胞及動物模式做進一步的藥物測試。
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    脊髓小腦運動失調症第十七型之微生物藥物篩檢模式：以 β-半乳糖苷酶結構互補特性偵測蛋白溶解度
    (2011) 郭欣嵐; Hsin-Lan Kuo
    多種遺傳性神經退化疾病為多麩醯胺 (polyglutamine, polyQ) 相關疾病，其中第十七型脊髓小腦萎縮症 (spinocerebellar ataxias type 17, SCA17)，於染色體 6q27 位置上的 TATA-box binding protein (TBP) 基因之轉譯區，發生 CAG 三核苷酸重複擴增導致，可能的分子致病機制為突變的 TBP 蛋白上具有擴增的多麩醯胺片段，造成蛋白結構錯誤摺疊，導致轉錄調控功能喪失。因此，建立一個可篩選出有助於抑制 TBP 蛋白聚集之藥物的篩檢模式，對於治療第十七型脊髓小腦萎縮症是極重要之事。根據 β-半乳糖苷酶 (β-galactosidase, β-gal) 蛋白結構中的 α 和 ω 二片段可互補形成具活性之酵素的特性。本研究建立表達 TBP/α 融合蛋白之大腸桿菌表達系統，此系統藉由含多麩醯胺擴增的 TBP 蛋白不正常聚集，連帶影響 α 片段構形，而無法形成有活性的 β-半乳糖苷酶，導致無法代謝 X-gal，菌落無法呈現藍色的表現型。經表現型分析、基因型分析、西方轉漬分析及 β-半乳糖苷酶比活性分析，發現以 JM109(DE3) 大腸桿菌作為pGEX-5x-3-fTBP(Q40)-lacZα 質體之表達宿主，表達出不溶性 fTBP(Q40)/α 融合蛋白，菌體不具有 β-半乳糖苷酶活性，呈現出符合微生物藥物篩檢系統所必須具備的非藍色表現型。故選定 JM109(DE3)/pGEX-5x-3-fTBP(Q40)-lacZα 作為微生物藥物篩檢的模式菌株。並以海藻糖處理模式菌株，發現海藻糖可抑制 fTBP(Q40)/α 融合蛋白聚集，可作為此微生物藥物篩檢系統之正控制組。利用盤式培養方式培養此菌株，可以應用於高通量的藥物篩檢，預期藉此系統可以快速篩選出可抑制多麩醯胺擴增之蛋白聚集的藥物，加速第十七型脊髓小腦萎縮症的藥物開發。