Browsing by Author "李冠群"

Now showing 1 - 20 of 23

人類海藻糖水解酶在大腸桿菌中的功能性表現與新型海藻糖水解酶抑制劑的檢測
(2013) 黃胤榮; Yin-Jung Huang
海藻糖水解酶、蔗糖酶-異麥芽糖 (sucrase-isomaltase, SI)、麥芽糖酶-葡萄糖澱粉酶 (maltase-glucoamylase, MG) 是哺乳類小腸絨毛膜主要的α-葡萄糖苷酶 (α-glucosidases)，這些酵素負責把雙醣水解成單醣，以利吸收作為能量的來源。海藻糖存在於很多食物當中，而小腸海藻糖水解酶 (EC 3.2.1.28) 會水解海藻糖 (1-α-D-glucopyranosyl α-D-glucopyranoside) 成為兩個葡萄糖分子。海藻糖對細胞有兩種保護的特性，亦即可當作化學伴護劑 (Chemical chaperone) 及細胞自噬反應引發劑 (inducer of autophagy)，實驗證實在神經細胞當中是可以運用在因蛋白質沉澱所造成的退化性神經疾病的藥物治療上。因此，如果能透過抑制腸道內的海藻糖水解酶活性，進而增加腸道內海藻糖吸收的話，這樣在血液和大腦中的海藻糖濃度也會增加，有可能改善由蛋白質沉澱所造成的退化性神經疾病。而人類海藻糖水解酶的結構、催化機制與其抑制劑到目前為止還沒有被研究清楚，本研究將人類海藻糖水解酶的cDNA在大腸桿菌裡表達，然而表達出來的重組蛋白質為內聚體 (inclusion body)，利用透析式摺疊 (Dialysis refolding) 和管柱色層層析摺疊法 (On-column refolding) 進行蛋白質再摺疊復性，但是再摺疊出來的重組蛋白質活性非常低。為了避免因蛋白分子間及分子內不正常的雙硫鍵形成而造成蛋白質錯誤的摺疊，以增加它的可溶性，根據三級結構的模擬把人類海藻糖水解酶中可能不涉及形成雙硫鍵的半胱胺酸 (cysteine) 殘基，利用定位突變法以絲氨酸 (serine) 來取代，其中預測出4個彼此距離較遠、較不可能形成雙硫鍵的半胱胺酸，並將它們突變為絲氨酸。然而突變的重組蛋白質仍為內聚體，而且再摺疊出來的重組蛋白質仍然沒有活性。另外，生化分析數種海藻糖的結構類似物對於豬的海藻糖水解酶的抑制作用，確定可以作為哺乳類海藻糖水解酶的抑制劑，這些類似物有可能作為治療由蛋白質沉澱所造成的神經性退化性疾病的藥物。關鍵字: 海藻糖、海藻糖水解酶、海藻醣水解酶抑制劑、重組蛋白質表達
利用表達Thermomyces lanuginosus脂肪酶之重組酵母菌進行原位合成生質柴油
(2017) 李欣蓓; Li, Hsin-Pei
生質柴油是一種可再生且具有環保性質的替代能源，目前利用生物法生產生質柴油，大多是以固定化酵素或全細胞為觸媒，而這些生物觸媒製備繁複、價格昂貴，會增加生產生質柴油的成本和能量消耗，因此需要開發新的具有經濟效益的生物觸媒及生物催化製程。本研究開發了一種同步整合重組脂肪酶製備與原位生質柴油合成的新製程，此製程以畢氏酵母菌Pichia pastoris表達重組疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶Thermomyces lanuginosus lipase ( TLL )，直接利用含有胞外酵素及全細胞的培養液作為觸媒催化生質柴油合成，而重組P. pastoris可以利用生質柴油合成過程中所產生的副產物-甘油做為碳源，持續製造分泌重組TLL至培養基中催化生質柴油合成。我們構築了重組質體pGAPZα-TLL，在P. pastoris X33中成功表達具有活性的TLL並分泌到培養基中，分析此重組TLL性質，顯示在37℃，pH 10具有最佳的水解活性，屬於耐鹼性酵素。以此重組P. pastoris培養液為觸媒，大豆油為原料，進行原位生質柴油合成，並採用兩種不同反應流程，即同步轉酯化與酯化反應(concurrent method) 與先水解再酯化逐步反應(stepwise method)，結果顯示這兩種反應流程，油相與水相(即培養液)混合的最佳體積比例相似(皆為1:3)，最佳的甲醇總添加量也相似(皆為32%)，但是所達到的生質柴油轉化率分別為88.9% (concurrent method) 與76.0% (stepwise method) 。我們嘗試在水相中控制添加相同菌量，即油相與培養液混合的體積比例固定為1:1，再以液體培養基調整水相體積，結果發現兩種反應流程的最佳油相與水相混合體積比例皆改變為1:5，最佳甲醇總添加量皆仍為32%，但是在生質柴油轉化率則顯著提升分別為91.4% (concurrent method) 與94.4% (stepwise method)，酵素活性測試亦顯示，控制添加相同菌量的培養液中含有較高的重組脂肪酶活性。本研究結果顯示，整合型生質柴油合成的產率顯著高於非整合型，而且以油相與培養液混合比例1:1，油相與總水相混合比例1:5，並以stepwise method添加32%甲醇，反應96小時後可得最高94.4%的生質柴油轉化率。這種簡化的製程無需酵素製備的過程，故可適用於工業生產生質柴油。
利用酵素工程技術提升海藻糖合成酶的酵素轉化效率
(2012) 曾信豪; Hsin -Hao Tseng
海藻糖 (trehalose) 存在於許多生物體當中，除了作為能量的儲存形式之外，在脫水等逆境時穩定蛋白質和生物膜的結構，保護細胞免於環境壓力。在食品、化妝、醫藥業上都有廣泛的應用。海藻糖合成酶 (trehalose synthase，TS) 為可逆催化麥芽糖分子內鍵結轉化成海藻糖的酵素，屬於一種麥芽糖異構酶，同時，TS 亦有水解麥芽糖產生葡萄糖的副反應，為海藻糖的生合成路徑之一。本研究在提升 TS 的轉化效率，並以Deinococcus radiodurans trehalose synthase (DrTS) 為研究對象，利用已知結構之 SI (sucrose isomerase) 為模板模擬出 DrTS 立體三級結構。結構顯示，DrTS 的整體結構與一般的 α-amylase 的結構相似，在中央擁有一個催化的區域，由 (β/α)8 的桶狀結構所組成，以及一個富有 loop 的子區域和兩個反向平行的 β-sheet 區域。藉由將麥芽糖偶合來模擬 DrTS 與受質結合的立體結構，發現距離麥芽糖 5 Å 的周圍有 21 個胺基酸會與受質結合。從 DrTS與 SI 的胺基酸序列與立體結構的比對，發現這 21 個胺基酸當中有 9 個是不相同的，推測這 9 個胺基酸可能造成 DrTS 與 SI 功能上有差異的原因，再與其他 TS 的胺基酸比對後，發現這 9 個不同的胺基酸中，有 3 個胺基酸不同於其他 TS，分別為 Thr154、Phe174 和 Gln254。推測這 3 個胺基酸位置可能是決定不同的 TS 具有不同生化性質或轉化率的原因，本研究利用定點飽和突變與高效率純化暨活性篩選系統針此 3 個胺基酸進行突變，篩選出高海藻糖轉化率突變種，其中在 Thr154 突變庫當中，挑選出兩株活性大於野生型三倍者，經 DNA 定序顯示其 Thr154皆被取代為 Phe。此外，Asn317 被預測可能與參與水解反應的水分子結合，而在 316 位置 DrTS 具有一種與其他 SI 明顯不保守的胺基酸 Arg，推測可能也會影響與水分子的結合，以及 Asn253 被預測可能藉由阻礙活性中心的開口處保護中間產物，避免水分子進入催化中心造成水解。為了減少水解的副反應，因此將親水性的 Asn317 藉由定位突變取代成疏水性的 Phe、Leu 或 Ala，並將帶正電的 Arg316 藉由定位突變取代成不帶電性的 Gly，結果顯示 Asn317 突變成 Phe、Leu 或 Ala 以及 Arg316 突變成 Gly 雖然會使水解副反應減少，然而卻會造成酵素活性降低。將 Asn253 藉由定位突變取代成芳香族的 Phe，結果顯示 Asn253 突變成Phe 會使水解副反應與酵素活性完全喪失。此外利用另兩種策略來改善 DrTS 轉化率。一種是偶合葡萄糖異構酶 (Glucose isomerase，GI)，將 TS 反應副產物葡萄糖轉化成果糖，來減少副產物的抑制效果，結果顯示偶合 GI 能提升 DrTS 在高溫的海藻糖轉化率約 4%。另一種方法是抑制 TS 的逆反應，藉由加入 α-葡萄糖苷酶抑制劑 (validoxylamine A、validamycin A、kanamycin A、acarbose 或 azactidine) 或是海藻糖的類似物 (lactose、lactulose 或 isomaltulose)。結果 kanamycin A 抑制逆反應比抑制正反應多 5% ，validoxylamine A、validamycin A 或 acarbose 對正逆反應的抑制程度相近，然而 azactidine、lactose、lactulose或 isomaltulose 對 DrTS 的正逆反應沒有影響。以上結果可以提供從事 TS 之蛋白質工程的參考。
嗜熱性細菌Thermus sp. BCRC17551之新型重組海藻糖合成酶的表達、定性與應用
(2018) 洪煜; Hung, Yu
海藻糖(trehalose)是一種非還原性雙糖，由兩分子的葡萄糖以α,α-1,1-糖苷鍵鏈結構成，可作為生物體的碳源與能量來源，亦具有保護蛋白質與脂質的功能，協助細胞抵抗脫水與結凍等極端環境壓力。海藻糖在食品、化妝品、醫藥產業上都有廣泛的應用。海藻糖合成酶(Trehalose synthase, TS)可以將低價的麥芽糖直接轉化為高價的海藻糖，而耐熱的海藻糖合成酶在海藻糖工業化生產中具有應用潛力。本實驗室已從食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心(BCRC)購得之菌株Thermus sp. BCRC17551分離出一種新型嗜熱性海藻糖合成酶(TTS)，其最適作用溫度為65℃，並已選殖到其蛋白質N端區域(nTTS)的基因片段，該片段所轉譯出之胺基酸序列(538 a.a.)，經過NCBI protein blast比對收尋，發現與其他已知12種Thermus genus TS N端區域有極高的保守性，序列相同度平均為90.4 %。已知嗜熱性菌株Thermus thermophilius ATCC33923之TS結構內具有一特殊C端區域(C-terminal domain, cTtTS)，該特殊結構對酵素之熱穩定性及高溫下酵素的異構化活性有重大影響。本研究發現以大腸桿菌中表達之重組nTTS的最適作用溫度(40℃)較原菌株所純化出的TTS (65℃)為低，藉由蛋白質工程將nTTS基因與cTtTS基因融合成nTTS-cTtTS基因，結果顯示該融合重組酵素最適作用溫度由40℃提高為60℃，活性提升6714倍。熱穩定性測試結果顯示，nTTS-cTtTS的熱變性自由能(ΔG°)較nTTS為高，顯示其熱變性所需之能量較大，較為穩定。上述結果顯示將nTTS結合cTtTS可以提升nTTS的嗜熱性與熱穩定性。受質專一性測試結果顯示，nTTS與nTTS-cTtTS皆可催化maltose、trehalose與sucrose，然而，nTTS對maltose與trehalose的異構化活性相近，但對trehalose的水解副反應活性高於對maltose，而nTTS-cTtTS對maltose的異構化活性高於對trehalose，但對maltose與trehalose的水解副反應活性則相近。此外，nTTS尚可以利用lactose作為受質，其產物可能是一種海藻糖類似物(galactosyl trehalose analogue, G-TA)，nTTS-cTtTS則無法作用lactose。海藻糖轉化率分析顯示，nTTS在其最適溫時海藻糖轉化率為31.9 %，但其水解成葡萄糖的副反應轉化率則高達26.8 %，nTTS-cTtTS在其最適溫的海藻糖轉化率為50.3 %，副反應葡萄糖轉化率則僅為14.7 %，顯示nTTS-cTtTS較nTTS具有高海藻糖合成效率與低水解活性。金屬離子與化學試劑對活性的影響測定結果顯示，nTTS與nTTS-cTtTS的活性均能被Ca2+促進，但是受Zn2+、Fe2+、Fe3+、Ni2+、Co2+或Cu2+抑制，而nTTS-cTtTS異構化活性會被Tris所抑制，但Tris能促進nTTS異構化活性高達4倍，顯示Tris可能會改變並穩定nTTS結構，使其適於生產海藻糖。酵素動力學結果顯示，在最適溫度40℃下，nTTS無法在接近受質的飽和濃度(2 M 麥芽糖或海藻糖)下達到Vmax，其Km值可能相當高。在最適溫度60℃下，nTTS-cTtTS以麥芽糖為受質Vmax為0.1028 (μmol / min)，Km為128.1 (mM)，kcat/Km為1.5 (s-1*mM-1); 以海藻糖為受質Vmax為0.1165 (μmol / min)，Km為270.0 (mM)，kcat/Km為0.8 (s-1*mM-1)，顯示nTTS-cTtTS對麥芽糖親和力較高，而且以麥芽糖為受質的催化效率較以海藻糖為受質高。當maltose和xylose同時存在下作為受質時，nTTS與nTTS-cTtTS均能合成新的醣類，這種醣類可能是一種海藻糖類似物(xylosyl trehalose analogue, X-TA)。另外，本研究藉由蛋白質工程技術構築nTTS-cTtTS與cellulose binding domain (CBD)融合基因，使酵素固定化於價格便宜之重製纖維素(regenerated amophous cellulose, RAC)上，重複使用實驗結果顯示，nTTS-cTtTS-CBD-RAC能於8次的重複使用後仍保持50 %以上的活性，且每次重複使用的轉化率分析結果顯示，nTTS-cTtTS-CBD-RAC能在重複使用中保持一致的高海藻糖轉化率 (皆約56 %)，顯示其酵素轉化特性沒有因重複使用而改變。在最適溫度測定結果顯示，nTTS-cTtTS-CBD-RAC的最適溫度較nTTS-cTtTS-CBD低約5℃，顯示CBD與RAC結合的構型可能會略為影響到nTTS-cTtTS-CBD在高溫下的活性。但nTTS-cTtTS-CBD-RAC的pH穩定性較nTTS-cTtTS獲得提升。本研究發現cTtTS對nTTS的嗜熱性、熱穩定性、減少水解反應與受質專一性有顯著的影響。而重組nTTS有許多一般海藻糖合成酶所沒有的特殊催化功能，後續蛋白質工程研究，應可提升這些催化功能的效率，並應用於海藻糖類似物的合成。固定化nTTS-cTtTS-CBD在價格便宜之RAC上能多次重複使用，有助於降低海藻糖工業生產成本，具有極大的工業應用價值。
嗜熱菌Thermus thermophilus海藻糖合成酶之蛋白質工程
(2016) 劉依萍; Liu, Yi-Ping
海藻糖(trehalose)是由兩分子葡萄糖以α-1,1-糖苷鍵連接而成的非還原性雙糖，能作為生物體內能量儲存與碳源的型式，以及在惡劣環境下，用以穩定生物膜與防止蛋白質變性的保護因子。因其具有許多特殊的物理及化學性質，海藻糖目前已廣泛應用於食品、化妝品及醫藥等工業。海藻糖合成酶(trehalose synthase，TS)可直接將麥芽糖異構化(isomerization)成海藻糖。由於反應只需要單一酵素且原料便宜，具有應用在工業上生產海藻糖的潛力。然而TS催化的反應為可逆反應，亦能將海藻糖轉化成麥芽糖，同時，TS具有不可逆的麥芽糖水解副反應，此水解反應會隨溫度上升而增加，而且副反應產物葡萄糖對TS活性具有抑制作用。因此，逆反應及副反應兩者都會導致海藻糖產量下降，若能降低TS的逆反應速率，以及增進熱穩定性，使水解反應降低，則可以提升海藻糖轉化率，使TS更適於工業應用。Thermus thermophilus海藻糖合成酶(TtTS)是目前已知的一種嗜熱性TS，具有工業應用優勢，但基因重組之TtTS於高溫(65℃)時轉化率僅52%，產量不高，因此本研究期望藉由蛋白質工程技術提高TtTS反應速率與轉化率。提升反應速率方面使用兩種策略，一種為給予TS偏好的受質alpha麥芽糖為正反應作用的主要受質，結果顯示，TS於含有較多alpha麥芽糖的反應中，反應速率提升，但轉化率沒有改變。另一種方法是利用偶合葡萄糖異構酶(Glucose isomerase，GI)，將TS副產物葡萄糖轉化成果糖，來減少副產物的抑制效果，結果顯示，適量的GI能提升TS反應速率，然而對於最終的轉化率仍沒有影響。在提升TtTS轉化率方面，根據模擬的嵌合麥芽糖與海藻糖之TtTS三級結構，分析酵素與受質的結合情況，預測出與麥芽糖無明顯結合力，並且不具有TS家族保守性的胺基酸有Phe141、Phe163、Ile140、Asn244，搭配本研究所建立的高通量TS純化暨活性篩選系統，分別進行四個位點之定位飽和突變，以及多點飽和突變，此外，亦進行TtTS全基因的隨機突變，進行酵素定向演化。結果顯示，篩選足夠數量的單位點定位飽和突變庫後，未發現高於原TtTS轉化效率之突變株，而多點飽和突變與隨機突變庫中各挑了1000個突變株，亦尚未篩選到轉化率提升之突變株。經定序發現，當Phe141突變為Leu141且Phe163突變為Val163時，具有協同作用，能維持轉化率與原TtTS相當，此結果顯示，多點飽和突變的策略非常有機會能組合出轉化率提升的突變酵素。然而，多點飽和突變與隨機突變需要篩選龐大數量之突變株，研發更高效率的篩選系統將有助於得到轉化率提升之突變株。
多麩醯胺擴增TBP 與HMGB1 的交互作用研究
(國立臺灣師範大學生命科學學系, 2013-??-??) 楊淑婷; 陳襄銘; 李麗卿; 黃詩涵; 林志信; 李冠群; 李振綱; 李桂楨; Shu-Ting Yang, Hsiang-Ming Chen, Li-Ching Lee, Shih-Han Huang, Chih-Hsin Lin, Guan-Chiun Lee, Cheng-Kang Lee, Guey-Jen Lee-Chen
第十七型脊髓小腦共濟失調症(SCA17)與轉錄起始因子TATA binding protein (TBP)基因上的多麩醯胺擴增相關。TBP 與包括high mobility group box 1 (HMGB1)在內的其他蛋白因子交互作用，來調節基因的表現。本研究藉重組的HMGB1 及TBP/Q20~61 N 端蛋白，探討TBP Q 長度是否影響其與HMGB1 的結合。首先共表現HMGB1 及TBP 於 HEK-293 細胞後，利用免疫共沉澱及GSTpull-down 試驗，確認HMGB1 與 TBP 在細胞內的結合。其次原核E. coli 表現的重組HMGB1 及TBP/Q20~61 蛋白的GST pull-down 試驗，亦顯示HMGB1 與TBP 的結合。最後即時石英晶體微量天平(QCM)試驗顯示，HMGB1-TBP 交互作用隨TBP 蛋白上polyQ 長度的增加而減弱。綜合先前報導的HMGB1-TBP 交互作用可增強TBP 結合TATA 速率及穩定性，我們的研究顯示多麩醯胺擴增TBP 與HMGB1 結合的減弱，可能與SCA17 致病機轉相關。
建立海藻糖合成酶之高效率純化暨活性篩選系統
(2010) 張紘綸
海藻糖（trehalose）為兩個葡萄糖以α1-1鍵結形成的非還原性雙糖，存在於許多生物體當中，可以作為能量的儲存形式，在脫水等逆境時穩定蛋白質和生物膜的結構，保護細胞免於環境壓力。在食品、化妝、醫藥業上都有廣泛的應用。海藻糖合成酶（trehalose synthase、TreS）為催化麥芽糖分子內鍵結轉化成海藻糖的酵素，並產生副產物葡萄糖，為海藻糖的生合成路徑之一。因為是單一酵素反應，在應用上易於控制流程，且原物料便宜與穩定，在生產海藻糖上有很大的潛力。傳統海藻糖合成酶活性測定的方式有HPLC與海藻糖水解酶（trehalase）呈色法，但這兩種方式有費時、費用昂貴與測定標的物專一性等問題，無法快速大量分析不同活性之TreS。本實驗建立了一套新的微量盤式麥芽糖水解酶（maltase）呈色法來進行大量且快速的活性分析。本法在TreS活性測定上更有效率，準確度高且不會有專一性不足的問題，適用於大量TreS樣品的分析。未來在TreS的蛋白質工程上，如定向演化上可以對大量的突變TreS進行活性篩選，來挑選出高轉化率或是高熱穩定性的突變TreS。
建立高重組蛋白表達之酵母菌Pichia Pastoris系統
(國立臺灣師範大學生命科學學系, 2012-07-??) 郭亭君; 張瀞文; 李振綱; 李冠群; Ting-Chun Kuo; Jing-Wen Chang; Cheng-Kang Lee; Guan-Chun Lee
利用真核表現系統來製造生產重組蛋白質已被廣泛應用於醫藥、食品與化學工業等方面，嗜甲醇酵母菌Pichia pastoris是目前最常被用來大量表達重組蛋白質的真核表達系統，但由於不同外源基因在P. pastoris中經常會有不同的重組蛋白質表達量，為了要建立一個能穩定且大量表達重組蛋白質的系統，有許多研究報告提出增加外源基因在P. pastoris表達量的方法。本研究採用操縱細胞整體轉錄作用（global transcription machinery engineering）的技術，以提升Candida rugosa重組脂肪酶在P. pastoris的表達量，藉由隨機突變P. pastoris的重要轉錄因子SPT15（一種TATA-binding protein），達到改變P. pastoris的轉錄體（transcriptome），進而影響Candida rugosa重組脂肪酶（lipase）的表達量。利用高通量（high-throughput）脂肪酶活性測定法，挑出具有高脂肪酶表達量的突變株。目前已從464個突變株當中，篩選出16個突變株其脂肪酶表達量高於野生型1.5倍以上，其中最高的一株表達量為野生型的2.3倍。此結果顯示操縱P. pastoris整體轉錄作用可以提升外源重組蛋白在P. pastoris的表達量。
建立高重組蛋白表達之酵母菌Pichia Pastoris系統
(國立臺灣師範大學生命科學學系, 2012-07-??) 郭亭君; 張瀞文; 李振綱; 李冠群; Ting-Chun Kuo; Jing-Wen Chang; Cheng-Kang Lee; Guan-Chun Lee
利用真核表現系統來製造生產重組蛋白質已被廣泛應用於醫藥、食品與化學工業等方面，嗜甲醇酵母菌Pichia pastoris是目前最常被用來大量表達重組蛋白質的真核表達系統，但由於不同外源基因在P. pastoris中經常會有不同的重組蛋白質表達量，為了要建立一個能穩定且大量表達重組蛋白質的系統，有許多研究報告提出增加外源基因在P. pastoris表達量的方法。本研究採用操縱細胞整體轉錄作用（global transcription machinery engineering）的技術，以提升Candida rugosa重組脂肪酶在P. pastoris的表達量，藉由隨機突變P. pastoris的重要轉錄因子SPT15（一種TATA-binding protein），達到改變P. pastoris的轉錄體（transcriptome），進而影響Candida rugosa重組脂肪酶（lipase）的表達量。利用高通量（high-throughput）脂肪酶活性測定法，挑出具有高脂肪酶表達量的突變株。目前已從464個突變株當中，篩選出16個突變株其脂肪酶表達量高於野生型1.5倍以上，其中最高的一株表達量為野生型的2.3倍。此結果顯示操縱P. pastoris整體轉錄作用可以提升外源重組蛋白在P. pastoris的表達量。
念珠藻Nostoc punctiforme胞外多醣生合成調控機制之預測
(國立臺灣師範大學生命科學學系, 2014-12-??) 曾志彧; 楊萌皓; 李冠群; Chih-Yu Tseng, Ming-Ho Iunn, Guan-Chiun Lee
藍菌念珠藻屬念珠藻屬 (Nostoc) 的胞外多醣胞外多醣 (exopolysaccharides, EPS)生合成相關之遺傳與生化方面的瞭解，目前研究並不多，為探討，為探討念珠藻屬EPS生合成基因可能受到那些轉錄因子調控，進而了解EPS生合成與環境因子的關係，本研究以念珠藻屬中基因體序列已被完整解碼的Nostoc punctiforme ATCC 29133為研究對象，針對其基因體中10個可能參與EPS生合成的基因啟動子區域做序列分析，共預測出15種轉錄因子轉錄因子結合位，藉由與大腸桿菌(Escherichia coli) 轉錄因子結合位序列的相似性相似性比對，預測最有可能會調控EPS生合成基因的轉錄因子為ArgR、Fnr與LexA。最後，利用E. coli K12之ArgR、Fnr與LexA胺基酸序列於N. punctiforme基因體中進行BLAST比對搜尋，結果顯示N. punctiforme具有與具有與E. coliK12相似度極高的轉錄因子LexA，但不具有相似的ArgR與Fnr。因此推測念珠藻N.punctiforme的EPS生合成基因可能會受轉錄因子LexA與其相關環境因子的調控，例如紫外線。
念珠藻念珠藻NostocNostocNostoc punctiformepunctiformepunctiformepunctiformepunctiforme胞外多醣生合成調控機制胞外多醣生合成調控機制胞外多醣生合成調控機制胞外多醣生合成調控機制之預
(國立臺灣師範大學生命科學學系, 2014-12-??) 曾志彧; 楊萌皓; 李冠群; Chih-Yu Tseng, Ming-Ho Iunn, Guan-Chiun Lee
藍菌念珠藻屬念珠藻屬 (NostocNostocNostocNostocNostoc) 的胞外多醣胞外多醣 (exopolysaccharides, EPS)(exopolysaccharides, EPS)(exopolysaccharides, EPS)(exopolysaccharides, EPS)(exopolysaccharides, EPS)(exopolysaccharides, EPS)(exopolysaccharides, EPS)(exopolysaccharides, EPS)(exopolysaccharides, EPS)(exopolysaccharides, EPS)(exopolysaccharides, EPS)(exopolysaccharides, EPS)(exopolysaccharides, EPS)(exopolysaccharides, EPS)(exopolysaccharides, EPS)(exopolysaccharides, EPS)(exopolysaccharides, EPS)(exopolysaccharides, EPS) 生合成相關之遺傳與化生合成相關之遺傳與化生合成相關之遺傳與化生合成相關之遺傳與化生合成相關之遺傳與化方面的瞭解，目前研究並不多研究並不多，為探討，為探討念珠藻屬念珠藻屬EPSEPSEPS生合成基因可能受到那些轉錄子調控生合成基因可能受到那些轉錄子調控生合成基因可能受到那些轉錄子調控生合成基因可能受到那些轉錄子調控生合成基因可能受到那些轉錄子調控生合成基因可能受到那些轉錄子調控生合成基因可能受到那些轉錄子調控，進而了解EPSEPSEPS生合成與環境因子的關係成與環境因子的關係成與環境因子的關係成與環境因子的關係，本研究以念珠藻屬中基因體序列已被完，本研究以念珠藻屬中基因體序列已被完，本研究以念珠藻屬中基因體序列已被完，本研究以念珠藻屬中基因體序列已被完，本研究以念珠藻屬中基因體序列已被完，本研究以念珠藻屬中基因體序列已被完，本研究以念珠藻屬中基因體序列已被完整解碼的NostocNostocNostocNostocNostoc punctiforme punctiforme punctiforme punctiforme punctiforme punctiforme punctiforme ATCC 29133ATCC 29133ATCC 29133ATCC 29133ATCC 29133ATCC 29133ATCC 29133ATCC 29133ATCC 29133ATCC 29133為研究為研究對象，針對其基因體中，針對其基因體中，針對其基因體中10個可能參與個可能參與EPSEPSEPS生合成的基因啟動子區域做序列分析，生合成的基因啟動子區域做序列分析，生合成的基因啟動子區域做序列分析，生合成的基因啟動子區域做序列分析，生合成的基因啟動子區域做序列分析，生合成的基因啟動子區域做序列分析，共預測出共預測出15種轉錄因子轉錄因子結合位，藉由與大腸桿菌與大腸桿菌 (Escherichia coliEscherichia coliEscherichia coliEscherichia coliEscherichia coliEscherichia coliEscherichia coliEscherichia coli) 轉錄因子結合位序列轉錄因子結合位序列轉錄因子結合位序列轉錄因子結合位序列的相似性相似性比對，比對，預測最有可能會調控會調控EPSEPSEPS生合成基因的轉錄因子為的轉錄因子為的轉錄因子為ArgRArgRArgRArgR、FnrFnr與LexALexALexALexA。最後，利用E. coli E. coli E. coli E. coli E. coli E. coli K12K12之ArgRArgRArgRArgR、FnrFnr與LexALexALexALexA胺基酸胺基酸序列於序列於N. punctiformeN. punctiformeN. punctiformeN. punctiformeN. punctiformeN. punctiformeN. punctiformeN. punctiformeN. punctiforme基因體中基因體中進行BLASTBLASTBLAST比對搜尋比對搜尋，結果顯示，結果顯示，結果顯示N. punctiformeN. punctiformeN. punctiformeN. punctiformeN. punctiformeN. punctiformeN. punctiformeN. punctiformeN. punctiformeN. punctiforme具有與具有與E. co
念珠藻麥芽寡糖苷海藻糖合成酶及水解酶之選殖、表現及特性分析
(2011) 杜欣宜; Hsin-Yi Tu
海藻糖是由兩個葡萄糖中間以α,α-1,1-糖苷鍵結的非還原性雙醣類。海藻糖廣泛存在於植物、昆蟲、酵母菌及細菌中。海藻糖可以保護生物體抵抗各種壓力，例如冷、熱、乾燥等。海藻糖可以應用在許多方面，例如當作食品的甜味劑、防腐劑、穩定劑、使用在化妝品或藥品。在工業生產海藻糖，可以利用maltooligosyltrehalose synthase (MTS) 和 maltooligosyltrehalose trehalohydrolase (MTH) 酵素系統，將低價的澱粉轉化為高價的海藻糖以降低成本。原核生物的藍綠菌Cyanobacteria Nostoc可以生長在極端的環境下，並且在乾燥的狀況下細胞可以累積海藻糖。在Nostoc punctiforme IAM M-15 及 Nostoc flagelliforme已被證明了在乾燥的壓力下，MTS及MTH的RNA表現量會增加。因此，推測Nostoc在乾燥的壓力下，MTS和MTH會參與反應以促進海藻糖的合成，提升細胞內海藻糖的濃度，以度過乾燥的環境。2001年，Nostoc punctiforme PCC 73102的完整基因體序列已經被定序，但它的MTS和MTH性質尚未被研究。除此之外，我們由台灣的烏來採集了Nostoc sphaeroides當作研究對象。本論文由Nostoc punctiforme PCC 73102 (NP) 及 Nostoc sphaeroides選殖MTS及MTH的基因，並以大腸桿菌表達重組酵素。並針對NPMTS作生化特性之分析，NPMTS重組酵素的最適溫度為30℃，最適pH值為8。NPMTS放置在10~30℃ 1小時酵素仍可維持穩定。額外加入1 mM的Ca2+、K+、Mg2+、Na+或Mn2+離子可略為增加NPMTS的活性，然而添加Cu2+及Zn2+離子則會抑制酵素活性。NPMTS以maltohexaose當受質時的轉糖活性較使用maltopentaose、maltotetraose、maltotriose和amylase高。然而，當使用maltotriose當受質時，NPMTS之水解活性會升高。NPMTS使用maltohexaose當作受質時的Km為57.9 mM，Vmax為1.9 U/mg. 以上結果闡述了此麥芽寡糖苷海藻糖合成酶之特性，並提供未來在生物技術的應用上，改進NPMTS的線索。
提升枯草桿菌脂肪酶的催化活性與改變其受質特異性
(2015) 李亞翰; Li, Ya-Han
Bacillus subtilis脂肪酶(B. subtilis lipase, BSL)已經被應用在食品、洗滌劑、皮革和廢油處理等方面。成熟具活性的BSL (mature BSL, mBSL)蛋白分子是由181個胺基酸組成，是目前已知分子量最小的脂肪酶，在pH 10具有最佳活性，屬於嗜鹼性脂肪酶，但最適作用溫度為35℃，耐熱性較差，在受質特異性方面，則對含短、中碳鏈脂肪酸受質有較高的催化活性。另一種嗜高溫古生菌Archaeoglobus fulgidus脂肪酶(AFL)具有嗜熱與嗜鹼的特性，最適作用條件分別為，pH值為10.0、溫度為90℃。BSL與AFL的X-ray結晶立體結構已經被解出，AFL的 C-端區域具獨特的功能，對於長碳鏈受質的結合及穩定酵素結構扮演重要角色，而mBSL與AFL的N-端區域具有相似結構。為了提升mBSL的耐熱特性，並改變其受質特異性，本研究藉由overlap PCR將mBSL與AFL的C-端區域基因融合，以獲得融合酵素mBSL-cAFL，同時亦配合電腦模擬針對融合酵素進行蛋白質工程。重組融合酵素於E. coli中表達和純化，經過性質分析後，發現突變株 mBSL-cAFL(181+239)在高溫下(50℃)對於短碳鏈脂肪酸受質的水解活性，較mBSL提升約57%，顯示AFL C-端區域具有提升mBSL熱穩定性的作用；而修改mBSL與AFL的C-端區域間的連結區結構[mBSL-cAFL(175+245) and mBSL-cAFL(175+linker+245)]，以及針對脂肪酸結合位所作的修飾[mBSL-cAFL(175+245)/F373A]，並無法提升對中、長碳鏈脂肪酸受質的水解活性；針對催化三元體中的Asp133所製作的突變株mBSL-cAFL(175+245)/D133A和mBSL-cAFL(175+245)/D133E，顯示融合酵素在高溫下可能是以具有催化二元體的形式來進行催化作用。為了擴展BSL的工業用途，需要進行更多的蛋白質工程，以便進一步提升其熱穩定性、與改變其受質特異性成為適合催化長碳鏈脂肪酸受質的脂肪酶。關鍵字：枯草桿菌脂肪酶、Archaeoglobus fulgidus 脂肪酶
提高酵母菌 Pichia pastoris 蛋白表達系統的重組蛋白產量
(2010) 翁啟翔; Chi-Hsiang Weng
酵母菌 Pichia pastoris 已被廣泛應用於外源基因的蛋白表達。此系統具有將重組蛋白分泌至細胞外的特色，又 P. pastoris 本身產生之分泌性蛋白數量少，因而可以藉由簡單的方式，直接純化培養液中的重組蛋白。然而，並非所有重組蛋白本身含有之分泌性序列皆可於 P. pastoris 系統中具有功能，目前發展出許多不同之分泌性序列用以成功將重組蛋白分泌至 P. pastoris 細胞外。故取得高產量之分泌性重組蛋白，首先則必須找尋一最合適之分泌性序列。本研究係藉由篩選九種不同的分泌性訊號序列，找尋一具有高效率的訊號序列，來提高分泌至細胞外的重組蛋白以增加產量，並以 Candida rugosa lipase 作為表達之重組蛋白，利用 lipase 活性測試來篩選出最佳之訊號序列。研究結果發現，該重組蛋白最合適之分泌性序列為來自 Gallus gallus lysozyme 之分泌性訊號序列。此結果顯示，lysozyme 之分泌性訊號序列有助於提升 C. rugosa lipase 在 P. pastoris 表達產量，其活性分析結果為 37 unit / ml，與表現量最差者相差 10 倍。同時，此篩選系統亦可應用於其他重組蛋白於 P. pastoris 系統中的表達，以提升重組蛋白之產量。
海藻糖對DNA遭受紫外線破壞之保護作用
(2010) 呂學樺; Hsueh-Hua Lu
海藻糖（trehalose）是由兩個葡萄糖分子藉α,α-1,1-鍵結而成的非還原性雙糖，自然界中即存在，常見於植物、低等無脊椎動物以及大多微生物如真菌、細菌及古生菌中。海藻糖在自然界所扮演的角色是生物體抵抗逆境的重要分子。被認為是穩定蛋白質、細胞膜與DNA，提高存活率的重要因素。細胞內的海藻糖是否能夠提供DNA對放射線的保護性，目前尚未見報導。本研究在證明E. coli細胞內的海藻糖能提供DNA對UV破壞的保護效果。藉由對pyrimidine dimer具專一性的T4 pdg酵素切割，以及DNA鹼性電泳的定量分析，決定不同UV照射劑量下DNA所產生的cyclobutane pyrimidine dimers （CPDs），以此為判斷DNA損傷程度的主要指標。並分析DNA傷害程度與海藻糖之間的關係。首先在活體外，以萃取純化好的E. coli基因體DNA混合在不同濃度的海藻糖中進行UV照射，確認了UV劑量越高，對應DNA完整性越低，而且在相同劑量下，高濃度海藻糖（100 mM）對DNA的保護效果較低濃度或不含海藻糖要好。在活體E. coli細胞內，藉由誘導海藻糖合成酶基因的表現使細胞內累積海藻糖，並進行UV照射加以分析，結果發現累積海藻糖的菌株在720 J/m2 的UV劑量下所造成的傷害為22 CPDs/Mbs，沒有累積海藻糖的菌株則是46 CPDs/Mbs。此研究結果證明海藻糖不但在活體外提供DNA抵抗UV之保護性，同時在證明在活體細胞中的海藻糖也具有保護DNA抵抗UV對其結構的破壞作用。
禽類IgY抗體在新冠病毒之保護、預防與檢測研究
(2023) 葉嘉翠; Yeh, Chia-Tsui
因應對生物醫學研究的需求，實驗動物的福祉及符合動物實驗3R的要求日益提升。過去以小鼠、兔子、山羊、牛、馬…等傳統動物模式來產製多株抗體的方式，將被嚴格的監督、要求與限制。所以尋找取代動物抗體產製的新方法及動物模式，成為一個非常重要的課題。蛋黃免疫球蛋白（yolk immunoglobulins，IgY），是卵黃中唯一的免疫球蛋白，以動物種源發生學的距離，哺乳類與鳥類的同源性低的優勢，可以產生具有高專一性的抗體，在某些免疫分析中，常用雞卵黃 IgY 替代哺乳類 IgG。IgY 特殊的分子結構與哺乳類免疫球蛋白略有差異，以至於不會引發有害人體的補體反應，也不會與類風濕性因子（rheumatoid factor）結合，也不會與哺乳動物的 IgG 產生交互作用（cross reaction）。只要收集免疫抗原後的雞蛋，加以純化取得卵黃中的抗體即可，不用犧牲動物或是長期侵入性的抽血取得動物血清。雞卵黃具有非侵入性、可持續高產量、飼育及純化成本低的種種優點，成為本研究中產製多株抗體的首選動物模式。本研究以抗原免疫蛋雞後，待蛋雞血清中專一性抗體濃度升高後，將蛋雞產出的雞蛋進行卵黃 IgY 抗體的純化，並進行抗體的專一性及靈敏度測試。本研究以新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）之刺突蛋白（又稱棘蛋白）（spike protein or S protein）蛋白次單元蛋白 S1、S2 誘發的 IgY 中和抗體，在 Vero E6 細胞株的感染中和力試驗中證明具有良好阻抗病毒的效果，進一步在倉鼠鼻滴定病毒感染試驗中，一次性投予抗 S 蛋白之 IgY 中和抗體，能有效降低新型冠狀病毒感染及病徵的嚴重程度。而 SARS-CoV-2 新型冠狀病毒抗N（nucleocapsid proteins；核殼蛋白）蛋白 IgY 抗體，則可專一且靈敏的於 11 株人類常見的呼吸道病毒試驗的酵素結合免疫吸附分析法（ELISA）試驗中，在 100~1000 個病毒的狀態下，檢測出 SARS-CoV-2 的病毒株。結果顯示誘發的 IgY 抗體具有高抗體效價特、專一性及中和力價。本研究亦誘發抗 SARS-CoV-2 病毒的 IgY 抗體，並且利用 IgY 抗體進行 ELISA、Western Blot、IHC、IF 等試驗的運用。總而言之，本研究證明了 IgY 抗體具有抵抗呼吸道傳染性病原的能力，可發展成具阻抗病原感染的預防和治療的中和性抗體藥品，及發展成更優良的檢測工具。
脂肪酶催化果醣脂肪酸酯的合成及應用
(2022) 陳詩云; Chen, Shih-Yun
脂肪酸糖酯是無毒、無味、無刺激性的界面活性劑。它們可以由再生資源生產，並且可以完全被生物降解。脂肪酸糖酯的應用已擴展到許多領域，包括製藥、化妝品、洗滌劑和食品工業。果糖是一種存在許多植物中的單糖酮醣，它通常與葡萄糖結合形成雙醣蔗糖。過去，本實驗室發現果糖具有抗內毒素和抗氧化的功能，這開啟了對果糖新的潛在功效和應用的研究。為了增加對內毒素的親和力，應增加果糖的疏水性。在本研究中，我們利用市售的固定化脂肪酶Novozymes 435催化脂肪酸酯和果糖之間的轉酯化反應，從而生成果糖酯。藉由MPLC和HPLC分析可獲得果糖轉化產率(69.2%)和各個果糖酯的產率(單丙酸果糖酯-1，即FMP1為23.4%、單丙酸果糖酯-2，即FMP2為21.6%、雙丙酸果糖酯，即FDP為29.6%、單月桂酸果糖酯，即FML2為24.2%)。這些果糖酯吸附內毒素和清除自由基的能力也已經透過生化分析進行。除此之外，在活體試驗中，我們也利用內毒素誘導Wistar雌性大鼠導致敗血症之模型，觀察果糖酯是否能保護模式老鼠，減輕因內毒素而引起的症狀，包括對組織血流量變化與損傷影響，此外也利用西方墨點法（western blotting）去進一步的觀察內毒素增加PARP、4HNE及caspase 3等細胞凋亡相關蛋白的變化。而果糖酯可以降低細胞凋亡蛋白的表現，證明果糖酯的保護效應。因此，本研究建立了果糖酯的酶合成法以用於工業應用，開發果糖酯的新型生化活性以用於醫藥、醫療器材和保健食品工業。
脊髓小腦運動失調症第十七型之微生物藥物篩檢模式：以微生物抗氯黴素能力作為篩檢標記
(2010) 永資陵; Zi-Ling Yong
目前已知有十種經遺傳的神經退化性疾病是和多麩醯胺(polyglutamine, polyQ)相關的疾病，其中第十七型脊髓小腦萎縮症(spinocerebellar ataxia type 17, SCA 17)是由於染色體上6q27位置的TATA binding protein (TBP)基因之轉譯區中，CAG三核苷酸發生重複擴增所導致。TBP基因所轉譯出來的蛋白質為細胞內重要的轉錄調節因子，而擴增的polyQ可能會影響到TBP蛋白的功能，因此推測SCA 17可能分子的致病機制為：突變的TBP蛋白質其擴增的polyQ片段，會導致蛋白質錯誤摺疊，最後形成不溶性的包涵體 (inclusion body)，進而造成神經細胞的功能異常、病變甚至死亡。而在活體(in vivo)和離體(in vitro)實驗中也可以發現，抑制錯誤延長性polyQ片段的蛋白聚集，可以抑制polyQ相關疾病的產生。本研究在大腸桿菌中建立TBP-chloramphenicol acetyltransferase (CAT，氯黴素乙醯轉移酶) 融合蛋白的表達系統，此細菌藥物篩檢模式是將TBP蛋白凝集現象與細菌細胞失去氯黴素抗藥性現象結合，亦即以抗藥性蛋白做為genetic marker protein，任何有助於蛋白溶解度提升之藥物，皆可藉由細菌本身抗藥性提升而被篩選出來。經表現型分析、基因型分析、西方轉漬分析及CAT 活性分析後，發現以Tuner、JM109、JM109(DE3)及BL21(DE3)大腸桿菌分別做為pGEX及pET system的表達宿主，此二表達系統符合篩藥條件(即長擴增的TBP片段抗藥性低於短擴增的TBP片段)，故Tuner/pGEX-tTBP60Q-CAT、JM109/pGEX-tTBP60Q-CAT、JM109(DE3)/pGEX-tTBP60Q-CAT及BL21(DE3)/pET-tTBP60Q-CAT可以作為篩藥模式。在建立篩檢模式之正控制組方面，選定Tuner/pGEX-tTBP60Q-CAT、JM109/pGEX-tTBP60Q-CAT及BL21(DE3)/pET-tTBP60Q-CAT微生物模式，以具有潛力之藥物(例如海藻糖及剛果紅)做測試，結果發現海藻糖及剛果紅似乎無法抑制不可溶性長擴增TBP蛋白凝集，可能是因海藻糖及剛果紅無法抑制此系統表達之長擴增TBP蛋白之凝集。當使用低溫誘導處理時，結果發現長擴增TBP蛋白溶解度提升，且其抗藥性有增加之現象，證明此系統可做為其他藥物之篩檢模式。本研究提供一種可以大量快速進行SCA17藥物篩檢的微生物模式，經由表現型分析、基因型分析、西方轉漬及CAT活性分析，找尋具有抑制長擴增TBP蛋白凝集之潛力藥物。
藉由啟動子工程改進pichia pastoris蛋白質表達系統之產量
(2013) 邱家鴻; Chia-Hung Chiu
嗜甲醇酵母菌 (Pichia pastoris) 系統已經被廣泛使用在重組蛋白的表達。此系統具有真核生物的優點，例如轉譯後修飾、蛋白可分泌至胞外、生長快速、以及其內毒素與病毒汙染的風險較低。Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAP) 的啟動子 (PGAP) 在 P. pastoris 系統中常被使用當作重組蛋白持續性表達的啟動子。這個持續性表達的 PGAP 系統具有穩定的基因表現特性，且因表達基因時無需使用誘導物，不會造成不同細胞間的轉錄程度異質性。經基因工程改造過後所得到的不同強度啟動子，可以用來調控基因表現以得到適當的蛋白表達量。為了增進在 P. pastoris 系統中蛋白表達量，本研究透過針對 GAP 啟動子序列隨機突變，建立一個突變庫以便篩選得到強的啟動子。篩選方法是使用抗抗生素 zeocin 基因 (即Streptoalloteichus hindustanus bleomycin gene, Sh ble gene) 當作報導基因。我們使用基因置換的轉型方式以去除多套插入的發生，避免套數多寡造成對啟動子篩選上的干擾。在高濃度的 zeocin 中，我們從 708 支轉型株中篩選到三支存活的突變株。經基因定序確認可能會影響啟動子強弱的突變位置。這些具較強轉錄活性的突變啟動子可以被應用在提高其他重組蛋白的表達。
重組Candida rugosa脂肪酶在Pichia pastoris的表達量提升及其在生產生質柴油的應用
(2015) 郭亭君; Ting-Chun Kuo
脂肪酶 (lipase) 在生物技術領域中，是一種極重要且具應用潛力的生物觸媒，已廣泛被應用於食品、醫藥、清潔劑、化學合成及油脂等工業。假絲酵母 (Candida rugosa) 脂肪酶具有廣效的受質特異性，是一種重要的工業用酵素，並已廣泛地被應用於生物技術領域中，該脂肪酶的組成包含了數種性質互異的同功酶 (isoenzymes)，先前的研究已將五種同功酶基因 (CRL1-5) 成功的在Pichia pastoris中表現具有活性的脂肪酶，並且證明了此五種同功酶的催化性質皆不相同。然而，在 Pichia 系統表達的脂肪酶產量尚未符合經濟效益，因此本研究選擇以CRL2 為研究目標，針對 Pichia 表達系統的轉錄、轉譯與全基因體層面設計了四個提升產量的策略，期望能提升蛋白的產量。(1) 在轉錄層面，首先我們藉由依序提高抗生素的濃度來增加LIP2 基因套數。當抗生素 Zeocin 濃度由 100 g/mL 提高至 500 g/mL，在 105 個轉型株當中，我們篩選到三個活性相較於其母株提升 2.4-5.8倍的菌株，結合低溫培養的策略，可再提升脂肪酶表達量至 32 倍，此方法可應用在提升其他四種同功酶在 Pichia 系統的產量；(2) 在轉錄層面，我們另一方面藉由隨機突變 Pichia 的 GAP 啟動子，建立一個突變庫以篩選較強的啟動子。在此策略下，我們構築一個雙同源互換的質體，利用抗生素為報導基因，成功建立啟動子篩選平台；(3) 在轉譯層面，我們希望藉由分泌蛋白胜肽 (-factor）的 mRNA 結構最適化，欲藉此提升轉譯的初始效率。透過隨機突變 -factor 的核甘酸序列但不改變氨基酸序列的情形下，我們由 1,500個突變株當中，篩選到兩個脂肪酶活性提升 1.2 倍的菌株，並且證實了突變株的5’ mRNA 結構的鍵結能量較野生株低；(4) 在全基因體層面，我們利用global transcription machinery engineering (gTME) 方法隨機突變 P. pastoris 的轉錄因子 TATA-binding protein，希望藉此改變全基因轉錄體，刺激細胞性狀改變，最後我們由 1,300個突變株當中，篩選到三個脂肪酶活性相較於野生株提升 1.5 倍的菌株。在重組CRL2的應用方面，目前尚未有利用市售 C. rugosa 脂肪酶針對非食用性油脂進行轉酯化，成功生產生質柴油的報導。本實驗利用 P. pastoris 表達的四個重組同功酶 (CRL1-CRL4)，針對非食用油進行轉酯化生產生質柴油的研究。結果顯示 CRL2 及 CRL4 對於痲瘋樹籽油轉酯化生產脂肪酸甲酯 (FAME) 有較好的催化效果。CRL2 於最適反應條件下 (50 wt% 水，初始添加1當量甲醇，24小時再追加 0.5 當量甲醇，於 37oC 下總共反應 48 小時) 可達到最大 FAME 產量 95.3%。此結果可證實 C. rugosa 單一種同功酶可當作轉化低價的痲瘋樹籽油為生質柴油的良好生物觸媒。