Browsing by Author "劉依萍"

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    嗜熱菌Thermus thermophilus海藻糖合成酶之蛋白質工程
    (2016) 劉依萍; Liu, Yi-Ping
    海藻糖(trehalose)是由兩分子葡萄糖以α-1,1-糖苷鍵連接而成的非還原性雙糖，能作為生物體內能量儲存與碳源的型式，以及在惡劣環境下，用以穩定生物膜與防止蛋白質變性的保護因子。因其具有許多特殊的物理及化學性質，海藻糖目前已廣泛應用於食品、化妝品及醫藥等工業。海藻糖合成酶(trehalose synthase，TS)可直接將麥芽糖異構化(isomerization)成海藻糖。由於反應只需要單一酵素且原料便宜，具有應用在工業上生產海藻糖的潛力。然而TS催化的反應為可逆反應，亦能將海藻糖轉化成麥芽糖，同時，TS具有不可逆的麥芽糖水解副反應，此水解反應會隨溫度上升而增加，而且副反應產物葡萄糖對TS活性具有抑制作用。因此，逆反應及副反應兩者都會導致海藻糖產量下降，若能降低TS的逆反應速率，以及增進熱穩定性，使水解反應降低，則可以提升海藻糖轉化率，使TS更適於工業應用。Thermus thermophilus海藻糖合成酶(TtTS)是目前已知的一種嗜熱性TS，具有工業應用優勢，但基因重組之TtTS於高溫(65℃)時轉化率僅52%，產量不高，因此本研究期望藉由蛋白質工程技術提高TtTS反應速率與轉化率。提升反應速率方面使用兩種策略，一種為給予TS偏好的受質alpha麥芽糖為正反應作用的主要受質，結果顯示，TS於含有較多alpha麥芽糖的反應中，反應速率提升，但轉化率沒有改變。另一種方法是利用偶合葡萄糖異構酶(Glucose isomerase，GI)，將TS副產物葡萄糖轉化成果糖，來減少副產物的抑制效果，結果顯示，適量的GI能提升TS反應速率，然而對於最終的轉化率仍沒有影響。在提升TtTS轉化率方面，根據模擬的嵌合麥芽糖與海藻糖之TtTS三級結構，分析酵素與受質的結合情況，預測出與麥芽糖無明顯結合力，並且不具有TS家族保守性的胺基酸有Phe141、Phe163、Ile140、Asn244，搭配本研究所建立的高通量TS純化暨活性篩選系統，分別進行四個位點之定位飽和突變，以及多點飽和突變，此外，亦進行TtTS全基因的隨機突變，進行酵素定向演化。結果顯示，篩選足夠數量的單位點定位飽和突變庫後，未發現高於原TtTS轉化效率之突變株，而多點飽和突變與隨機突變庫中各挑了1000個突變株，亦尚未篩選到轉化率提升之突變株。經定序發現，當Phe141突變為Leu141且Phe163突變為Val163時，具有協同作用，能維持轉化率與原TtTS相當，此結果顯示，多點飽和突變的策略非常有機會能組合出轉化率提升的突變酵素。然而，多點飽和突變與隨機突變需要篩選龐大數量之突變株，研發更高效率的篩選系統將有助於得到轉化率提升之突變株。